La diagnosi differenziale dei noduli polmonari identificati mediante tomografia computerizzata (TC) rimane una sfida nella pratica clinica. In questo studio, abbiamo caratterizzato il metaboloma globale di 480 campioni di siero, inclusi controlli sani, noduli polmonari benigni e adenocarcinoma polmonare di stadio I. Gli adenocarcinomi presentano profili metabolomici unici, mentre i noduli benigni e gli individui sani mostrano un'elevata similarità nei profili metabolomici. Nel gruppo di scoperta (n = 306), è stato identificato un set di 27 metaboliti per differenziare i noduli benigni da quelli maligni. L'AUC del modello discriminante nei gruppi di validazione interna (n = 104) ed esterna (n = 111) è risultata rispettivamente pari a 0,915 e 0,945. L'analisi dei pathway ha rivelato un aumento dei metaboliti glicolitici associato a una diminuzione del triptofano nel siero di pazienti con adenocarcinoma polmonare rispetto ai noduli benigni e ai controlli sani, suggerendo che l'assorbimento di triptofano promuova la glicolisi nelle cellule tumorali polmonari. Il nostro studio evidenzia il valore dei biomarcatori metabolici sierici nella valutazione del rischio di noduli polmonari rilevati tramite TC.
La diagnosi precoce è fondamentale per migliorare i tassi di sopravvivenza dei pazienti oncologici. I risultati del National Lung Cancer Screening Trial (NLST) statunitense e dello studio europeo NELSON hanno dimostrato che lo screening con tomografia computerizzata a bassa dose (LDCT) può ridurre significativamente la mortalità per cancro al polmone nei gruppi ad alto rischio1,2,3. Dall'ampio utilizzo della LDCT per lo screening del cancro al polmone, l'incidenza di riscontri radiografici incidentali di noduli polmonari asintomatici ha continuato ad aumentare4. I noduli polmonari sono definiti come opacità focali fino a 3 cm di diametro5. Ci troviamo di fronte a difficoltà nella valutazione della probabilità di malignità e nella gestione dell'elevato numero di noduli polmonari rilevati incidentalmente con la LDCT. I limiti della TC possono portare a frequenti esami di follow-up e a risultati falsi positivi, con conseguenti interventi non necessari e sovratrattamento6. Pertanto, è necessario sviluppare biomarcatori affidabili e utili per identificare correttamente il cancro al polmone nelle fasi iniziali e differenziare la maggior parte dei noduli benigni al momento della diagnosi iniziale7.
L'analisi molecolare completa del sangue (siero, plasma, cellule mononucleate del sangue periferico), che comprende genomica, proteomica o metilazione del DNA8,9,10, ha portato a un crescente interesse nella scoperta di biomarcatori diagnostici per il cancro al polmone. Nel frattempo, gli approcci metabolomici misurano i prodotti finali cellulari che sono influenzati da azioni endogene ed esogene e vengono quindi applicati per prevedere l'insorgenza e l'esito della malattia. La cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS) è un metodo ampiamente utilizzato per gli studi metabolomici grazie alla sua elevata sensibilità e all'ampio intervallo dinamico, che può coprire metaboliti con diverse proprietà fisico-chimiche11,12,13. Sebbene l'analisi metabolomica globale del plasma/siero sia stata utilizzata per identificare biomarcatori associati alla diagnosi del cancro al polmone14,15,16,17 e all'efficacia del trattamento,18 i classificatori di metaboliti sierici per distinguere tra noduli polmonari benigni e maligni devono ancora essere studiati a fondo.
L'adenocarcinoma e il carcinoma a cellule squamose sono i due principali sottotipi di carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC). Diversi test di screening con TC indicano che l'adenocarcinoma è il tipo istologico più comune di tumore polmonare1,19,20,21. In questo studio, abbiamo utilizzato la cromatografia liquida ad altissime prestazioni accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione (UPLC-HRMS) per eseguire un'analisi metabolomica su un totale di 695 campioni di siero, inclusi controlli sani, noduli polmonari benigni e noduli rilevati con TC di dimensioni ≤3 cm. Screening per l'adenocarcinoma polmonare di stadio I. Abbiamo identificato un pannello di metaboliti sierici che distinguono l'adenocarcinoma polmonare dai noduli benigni e dai controlli sani. L'analisi di arricchimento delle vie metaboliche ha rivelato che il metabolismo anomalo del triptofano e del glucosio sono alterazioni comuni nell'adenocarcinoma polmonare rispetto ai noduli benigni e ai controlli sani. Infine, abbiamo sviluppato e validato un classificatore metabolico sierico con elevata specificità e sensibilità per distinguere tra noduli polmonari maligni e benigni rilevati mediante LDCT, che può essere d'aiuto nella diagnosi differenziale precoce e nella valutazione del rischio.
Nel presente studio, sono stati raccolti retrospettivamente campioni di siero, abbinati per sesso ed età, da 174 soggetti sani di controllo, 292 pazienti con noduli polmonari benigni e 229 pazienti con adenocarcinoma polmonare di stadio I. Le caratteristiche demografiche dei 695 soggetti sono riportate nella Tabella supplementare 1.
Come mostrato nella Figura 1a, un totale di 480 campioni di siero, inclusi 174 controlli sani (HC), 170 noduli benigni (BN) e 136 campioni di adenocarcinoma polmonare di stadio I (LA), sono stati raccolti presso il Centro Oncologico dell'Università Sun Yat-sen. Coorte di scoperta per la profilazione metabolomica non mirata mediante cromatografia liquida ad altissime prestazioni-spettrometria di massa ad alta risoluzione (UPLC-HRMS). Come mostrato nella Figura supplementare 1, sono stati identificati i metaboliti differenziali tra LA e HC, LA e BN per stabilire un modello di classificazione e approfondire l'analisi dei percorsi differenziali. 104 campioni raccolti dal Centro Oncologico dell'Università Sun Yat-sen e 111 campioni raccolti da altri due ospedali sono stati sottoposti rispettivamente a validazione interna ed esterna.
a Popolazione di studio nella coorte di scoperta sottoposta ad analisi metabolomica globale del siero mediante cromatografia liquida ad altissime prestazioni-spettrometria di massa ad alta risoluzione (UPLC-HRMS). b Analisi discriminante dei minimi quadrati parziali (PLS-DA) del metaboloma totale di 480 campioni di siero della coorte di studio, inclusi controlli sani (HC, n = 174), noduli benigni (BN, n = 170) e adenocarcinoma polmonare di stadio I (Los Angeles, n = 136). +ESI, modalità di ionizzazione elettrospray positiva, -ESI, modalità di ionizzazione elettrospray negativa. c–e I metaboliti con abbondanze significativamente diverse in due gruppi dati (test di Wilcoxon a ranghi con segno a due code, valore p corretto per il tasso di falsa scoperta, FDR <0,05) sono mostrati in rosso (fold change > 1,2) e blu (fold change < 0,83). ) mostrati nel grafico a vulcano. f Mappa di calore del clustering gerarchico che mostra differenze significative nel numero di metaboliti annotati tra LA e BN. I dati di origine sono forniti sotto forma di file di dati di origine.
Il metaboloma sierico totale di 174 HC, 170 BN e 136 LA nel gruppo di scoperta è stato analizzato mediante analisi UPLC-HRMS. Mostriamo innanzitutto che i campioni di controllo qualità (QC) si raggruppano strettamente al centro di un modello di analisi delle componenti principali (PCA) non supervisionata, confermando la stabilità delle prestazioni del presente studio (Figura supplementare 2).
Come mostrato nell'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali (PLS-DA) nella Figura 1 b, abbiamo riscontrato chiare differenze tra LA e BN, LA e HC nelle modalità di ionizzazione elettrospray positiva (+ESI) e negativa (−ESI). Tuttavia, non sono state riscontrate differenze significative tra BN e HC nelle condizioni +ESI e -ESI.
Abbiamo trovato 382 caratteristiche differenziali tra LA e HC, 231 caratteristiche differenziali tra LA e BN e 95 caratteristiche differenziali tra BN e HC (test di Wilcoxon sui ranghi con segno, FDR <0,05 e variazione multipla >1,2 o <0,83) (Figura 1c-e). I picchi sono stati ulteriormente annotati (Dati supplementari 3) rispetto a un database (libreria mzCloud/HMDB/Chemspider) tramite valore m/z, tempo di ritenzione e ricerca dello spettro di massa di frammentazione (dettagli descritti nella sezione Metodi) 22. Infine, sono stati identificati 33 e 38 metaboliti annotati con differenze significative di abbondanza per LA rispetto a BN (Figura 1f e Tabella supplementare 2) e LA rispetto a HC (Figura supplementare 3 e Tabella supplementare 2), rispettivamente. Al contrario, solo 3 metaboliti con differenze significative di abbondanza sono stati identificati in BN e HC (Tabella supplementare 2), in linea con la sovrapposizione tra BN e HC in PLS-DA. Questi metaboliti differenziali coprono un'ampia gamma di sostanze biochimiche (Figura supplementare 4). Nel complesso, questi risultati dimostrano cambiamenti significativi nel metaboloma sierico che riflettono la trasformazione maligna del carcinoma polmonare in fase iniziale rispetto ai noduli polmonari benigni o ai soggetti sani. Allo stesso tempo, la somiglianza del metaboloma sierico di BN e HC suggerisce che i noduli polmonari benigni possano condividere molte caratteristiche biologiche con gli individui sani. Dato che le mutazioni del gene del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) sono comuni nel sottotipo 23 dell'adenocarcinoma polmonare, abbiamo cercato di determinare l'impatto delle mutazioni driver sul metaboloma sierico. Abbiamo quindi analizzato il profilo metabolomico complessivo di 72 casi con stato EGFR nel gruppo dell'adenocarcinoma polmonare. È interessante notare che abbiamo trovato profili comparabili tra pazienti con mutazione EGFR (n = 41) e pazienti con EGFR wild-type (n = 31) nell'analisi PCA (Figura supplementare 5a). Tuttavia, abbiamo identificato 7 metaboliti la cui abbondanza era significativamente alterata nei pazienti con mutazione EGFR rispetto ai pazienti con EGFR wild-type (test t, p < 0,05 e variazione di espressione > 1,2 o < 0,83) (Figura supplementare 5b). La maggior parte di questi metaboliti (5 su 7) sono acilcarnitine, che svolgono un ruolo importante nei processi di ossidazione degli acidi grassi.
Come illustrato nel flusso di lavoro mostrato nella Figura 2a, i biomarcatori per la classificazione dei noduli sono stati ottenuti utilizzando operatori di contrazione minima assoluta e selezione basata su 33 metaboliti differenziali identificati in LA (n = 136) e BN (n = 170). Migliore combinazione di variabili (LASSO) – modello di regressione logistica binaria. La convalida incrociata a dieci fold è stata utilizzata per testare l'affidabilità del modello. La selezione delle variabili e la regolarizzazione dei parametri sono regolate da una penalità di massimizzazione della verosimiglianza con parametro λ24. L'analisi metabolomica globale è stata ulteriormente eseguita indipendentemente nei gruppi di validazione interna (n = 104) ed esterna (n = 111) per testare le prestazioni di classificazione del modello discriminante. Di conseguenza, 27 metaboliti nel set di scoperta sono stati identificati come il miglior modello discriminante con il valore AUC medio più elevato (Fig. 2b), tra i quali 9 avevano un'attività aumentata e 18 un'attività diminuita in LA rispetto a BN (Fig. 2c).
Flusso di lavoro per la costruzione di un classificatore di noduli polmonari, inclusa la selezione del miglior pannello di metaboliti sierici nel set di scoperta utilizzando un modello di regressione logistica binaria tramite convalida incrociata a dieci fold e la valutazione delle prestazioni predittive nei set di validazione interni ed esterni. b Statistiche di convalida incrociata del modello di regressione LASSO per la selezione di biomarcatori metabolici. I numeri sopra riportati rappresentano il numero medio di biomarcatori selezionati a un dato λ. La linea tratteggiata rossa rappresenta il valore medio di AUC al corrispondente lambda. Le barre di errore grigie rappresentano i valori minimi e massimi di AUC. La linea tratteggiata indica il modello migliore con i 27 biomarcatori selezionati. AUC, area sotto la curva ROC (Receiver Operating Characteristic). c Variazioni di 27 metaboliti selezionati nel gruppo LA rispetto al gruppo BN nel gruppo di scoperta. Colonna rossa: attivazione. Colonna blu: declino. d-f Curve ROC (Receiver Operating Characteristic) che mostrano la potenza del modello discriminante basato su 27 combinazioni di metaboliti nei set di scoperta, di validazione interna ed esterna. I dati di origine vengono forniti sotto forma di file di dati di origine.
È stato creato un modello predittivo basato sui coefficienti di regressione ponderati di questi 27 metaboliti (Tabella supplementare 3). L'analisi ROC basata su questi 27 metaboliti ha prodotto un valore dell'area sotto la curva (AUC) di 0,933, una sensibilità del gruppo di scoperta di 0,868 e una specificità di 0,859 (Fig. 2d). Nel frattempo, tra i 38 metaboliti differenziali annotati tra LA e HC, un set di 16 metaboliti ha raggiunto un AUC di 0,902 con una sensibilità di 0,801 e una specificità di 0,856 nel discriminare LA da HC (Figura supplementare 6a-c). Sono stati confrontati anche i valori AUC basati su diverse soglie di variazione per i metaboliti differenziali. Abbiamo scoperto che il modello di classificazione ha ottenuto le migliori prestazioni nel discriminare tra LA e BN (HC) quando il livello di variazione è stato impostato a 1,2 rispetto a 1,5 o 2,0 (Figura supplementare 7a,b). Il modello di classificazione, basato su 27 gruppi di metaboliti, è stato ulteriormente validato in coorti interne ed esterne. L'AUC è risultata pari a 0,915 (sensibilità 0,867, specificità 0,811) per la validazione interna e a 0,945 (sensibilità 0,810, specificità 0,979) per la validazione esterna (Fig. 2e, f). Per valutare l'efficienza interlaboratorio, 40 campioni della coorte esterna sono stati analizzati in un laboratorio esterno come descritto nella sezione Metodi. L'accuratezza della classificazione ha raggiunto un AUC di 0,925 (Figura supplementare 8). Poiché il carcinoma a cellule squamose del polmone (LUSC) è il secondo sottotipo più comune di carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) dopo l'adenocarcinoma polmonare (LUAD), abbiamo anche testato la potenziale utilità validata dei profili metabolici. BN e 16 casi di LUSC. L'AUC della discriminazione tra LUSC e BN era pari a 0,776 (Figura supplementare 9), indicando una capacità inferiore rispetto alla discriminazione tra LUAD e BN.
Studi hanno dimostrato che le dimensioni dei noduli nelle immagini TC sono correlate positivamente con la probabilità di malignità e rimangono un fattore determinante per il trattamento dei noduli25,26,27. L'analisi dei dati dell'ampia coorte dello studio di screening NELSON ha mostrato che il rischio di malignità nei soggetti con noduli <5 mm era addirittura simile a quello nei soggetti senza noduli28. Pertanto, la dimensione minima che richiede un monitoraggio TC regolare è di 5 mm, come raccomandato dalla British Thoracic Society (BTS), e di 6 mm, come raccomandato dalla Fleischner Society29. Tuttavia, i noduli di dimensioni superiori a 6 mm e senza evidenti caratteristiche benigne, chiamati noduli polmonari indeterminati (IPN), rimangono una sfida importante nella valutazione e nella gestione nella pratica clinica30,31. Abbiamo quindi esaminato se le dimensioni del nodulo influenzassero le firme metabolomiche utilizzando campioni aggregati dalle coorti di scoperta e di validazione interna. Concentrandoci su 27 biomarcatori validati, abbiamo innanzitutto confrontato i profili PCA dei metabolomi di HC e BN sub-6 mm. Abbiamo scoperto che la maggior parte dei punti dati per HC e BN si sovrapponevano, dimostrando che i livelli di metaboliti sierici erano simili in entrambi i gruppi (Fig. 3a). Le mappe delle caratteristiche attraverso diversi intervalli di dimensioni sono rimaste conservate in BN e LA (Fig. 3b, c), mentre è stata osservata una separazione tra noduli maligni e benigni nell'intervallo 6-20 mm (Fig. 3d). Questa coorte aveva un'AUC di 0,927, una specificità di 0,868 e una sensibilità di 0,820 per predire la malignità dei noduli di dimensioni comprese tra 6 e 20 mm (Fig. 3e, f). I nostri risultati mostrano che il classificatore può catturare i cambiamenti metabolici causati dalla trasformazione maligna precoce, indipendentemente dalle dimensioni del nodulo.
ad Confronto dei profili PCA tra gruppi specificati sulla base di un classificatore metabolico di 27 metaboliti. CC e BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. in LA 6–20 mm contro LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm e LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Curva ROC (Receiver Operating Characteristic) che mostra le prestazioni del modello discriminante per i noduli 6–20 mm. f I valori di probabilità sono stati calcolati sulla base del modello di regressione logistica per i noduli di dimensioni comprese tra 6 e 20 mm. La linea tratteggiata grigia rappresenta il valore di cutoff ottimale (0,455). I numeri sopra rappresentano la percentuale di casi previsti per Los Angeles. Utilizzare un test t di Student a due code. PCA, analisi delle componenti principali. AUC, area sotto la curva. I dati di origine sono forniti sotto forma di file di dati di origine.
Quattro campioni (di età compresa tra 44 e 61 anni) con dimensioni simili dei noduli polmonari (7-9 mm) sono stati ulteriormente selezionati per illustrare le prestazioni del modello di previsione della malignità proposto (Fig. 4a, b). Allo screening iniziale, il Caso 1 si presentava come un nodulo solido con calcificazione, una caratteristica associata alla benignità, mentre il Caso 2 si presentava come un nodulo parzialmente solido indeterminato senza evidenti caratteristiche benigne. Tre cicli di scansioni TC di follow-up hanno mostrato che questi casi sono rimasti stabili per un periodo di 4 anni e sono stati quindi considerati noduli benigni (Fig. 4a). Rispetto alla valutazione clinica di scansioni TC seriali, l'analisi dei metaboliti sierici in un'unica misurazione con l'attuale modello di classificazione ha identificato rapidamente e correttamente questi noduli benigni sulla base di vincoli probabilistici (Tabella 1). La Figura 4b nel caso 3 mostra un nodulo con segni di retrazione pleurica, che è più spesso associata alla malignità32. Il Caso 4 si presentava come un nodulo parzialmente solido indeterminato senza evidenza di una causa benigna. Tutti questi casi sono stati classificati come maligni secondo il modello di classificazione (Tabella 1). La valutazione dell'adenocarcinoma polmonare è stata dimostrata dall'esame istopatologico dopo l'intervento chirurgico di resezione polmonare (Fig. 4b). Per il set di validazione esterna, il classificatore metabolico ha previsto con precisione due casi di noduli polmonari indeterminati di dimensioni superiori a 6 mm (Figura supplementare 10).
Immagini TC della finestra assiale dei polmoni di due casi di noduli benigni. Nel caso 1, la TC dopo 4 anni ha mostrato un nodulo solido stabile di 7 mm con calcificazione nel lobo inferiore destro. Nel caso 2, la TC dopo 5 anni ha rivelato un nodulo stabile, parzialmente solido, di 7 mm di diametro nel lobo superiore destro. b Immagini TC della finestra assiale dei polmoni e relativi studi patologici di due casi di adenocarcinoma di stadio I prima della resezione polmonare. Il caso 3 ha rivelato un nodulo di 8 mm di diametro nel lobo superiore destro con retrazione pleurica. Il caso 4 ha rivelato un nodulo parzialmente solido a vetro smerigliato di 9 mm nel lobo superiore sinistro. Colorazione con ematossilina-eosina (H&E) del tessuto polmonare resecato (barra di scala = 50 μm) che dimostra il pattern di crescita acinare dell'adenocarcinoma polmonare. Le frecce indicano i noduli rilevati nelle immagini TC. Le immagini H&E sono immagini rappresentative di più (>3) campi microscopici esaminati dal patologo.
Nel complesso, i nostri risultati dimostrano il potenziale valore dei biomarcatori metabolici sierici nella diagnosi differenziale dei noduli polmonari, che possono rappresentare una sfida nella valutazione dello screening mediante TC.
Sulla base di un pannello di metaboliti differenziali validato, abbiamo cercato di identificare i correlati biologici dei principali cambiamenti metabolici. L'analisi di arricchimento delle vie metaboliche KEGG tramite MetaboAnalyst ha identificato 6 vie metaboliche comuni significativamente alterate tra i due gruppi considerati (LA vs. HC e LA vs. BN, p corretto ≤ 0,001, effetto > 0,01). Questi cambiamenti erano caratterizzati da alterazioni nel metabolismo del piruvato, nel metabolismo del triptofano, nel metabolismo della niacina e della nicotinamide, nella glicolisi, nel ciclo di Krebs e nel metabolismo delle purine (Fig. 5a). Abbiamo quindi eseguito un'ulteriore metabolomica mirata per verificare i principali cambiamenti utilizzando la quantificazione assoluta. Determinazione dei metaboliti comuni nelle vie metaboliche comunemente alterate mediante spettrometria di massa a triplo quadrupolo (QQQ) utilizzando standard di metaboliti autentici. Le caratteristiche demografiche del campione target dello studio metabolomico sono incluse nella Tabella supplementare 4. In linea con i nostri risultati metabolomici globali, l'analisi quantitativa ha confermato che ipoxantina e xantina, piruvato e lattato erano aumentati in LA rispetto a BN e HC (Fig. 5b, c, p <0,05). Tuttavia, non sono state riscontrate differenze significative in questi metaboliti tra BN e HC.
Analisi di arricchimento del percorso KEGG dei metaboliti significativamente diversi nel gruppo LA rispetto ai gruppi BN e HC. È stato utilizzato un Globaltest a due code e i valori p sono stati aggiustati utilizzando il metodo Holm-Bonferroni (p aggiustato ≤ 0,001 e dimensione dell'effetto > 0,01). b–d Grafici a violino che mostrano i livelli di ipoxantina, xantina, lattato, piruvato e triptofano nel siero di HC, BN e LA determinati mediante LC-MS/MS (n = 70 per gruppo). Le linee tratteggiate bianche e nere indicano rispettivamente la mediana e il quartile. e Grafico a violino che mostra l'espressione di mRNA normalizzata Log2TPM (trascrizioni per milione) di SLC7A5 e QPRT nell'adenocarcinoma polmonare (n = 513) rispetto al tessuto polmonare normale (n = 59) nel dataset LUAD-TCGA. Il riquadro bianco rappresenta l'intervallo interquartile, la linea nera orizzontale al centro rappresenta la mediana e la linea nera verticale che si estende dal riquadro rappresenta l'intervallo di confidenza al 95% (CI). f Grafico di correlazione di Pearson dell'espressione di SLC7A5 e GAPDH nell'adenocarcinoma polmonare (n = 513) e nel tessuto polmonare normale (n = 59) nel dataset TCGA. L'area grigia rappresenta il CI al 95%. r, coefficiente di correlazione di Pearson. g Livelli di triptofano cellulare normalizzati in cellule A549 trasfettate con shRNA di controllo non specifico (NC) e shSLC7A5 (Sh1, Sh2) determinati mediante LC-MS/MS. Viene presentata l'analisi statistica di cinque campioni biologicamente indipendenti in ciascun gruppo. h Livelli cellulari di NADt (NAD totale, inclusi NAD+ e NADH) in cellule A549 (NC) e cellule A549 con silenziamento di SLC7A5 (Sh1, Sh2). Viene presentata l'analisi statistica di tre campioni biologicamente indipendenti in ciascun gruppo. i L'attività glicolitica delle cellule A549 prima e dopo il silenziamento di SLC7A5 è stata misurata tramite il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) (n = 4 campioni biologicamente indipendenti per gruppo). 2-DG,2-deossi-D-glucosio. Il test t di Student a due code è stato utilizzato in (b–h). In (g–i), le barre di errore rappresentano la media ± DS, ogni esperimento è stato eseguito tre volte in modo indipendente e i risultati sono stati simili. I dati di origine sono forniti sotto forma di file di dati di origine.
Considerando il significativo impatto dell'alterato metabolismo del triptofano nel gruppo LA, abbiamo anche valutato i livelli sierici di triptofano nei gruppi HC, BN e LA utilizzando il metodo QQQ. Abbiamo riscontrato che il triptofano sierico era ridotto nel gruppo LA rispetto ai gruppi HC o BN (p < 0,001, Figura 5d), il che è coerente con precedenti risultati che mostrano livelli circolanti di triptofano inferiori nei pazienti con tumore al polmone rispetto ai controlli sani del gruppo di controllo33,34,35. Un altro studio che ha utilizzato il tracciante PET/CT 11C-metil-L-triptofano ha rilevato che il tempo di ritenzione del segnale del triptofano nel tessuto tumorale polmonare era significativamente aumentato rispetto alle lesioni benigne o al tessuto normale36. Ipotizziamo che la diminuzione del triptofano nel siero del gruppo LA possa riflettere l'assorbimento attivo di triptofano da parte delle cellule tumorali polmonari.
È noto inoltre che il prodotto finale della via della chinurenina del catabolismo del triptofano è il NAD+37,38, che è un substrato importante per la reazione della gliceraldeide-3-fosfato con il 1,3-bisfosfoglicerato nella glicolisi39. Mentre studi precedenti si sono concentrati sul ruolo del catabolismo del triptofano nella regolazione immunitaria, abbiamo cercato di chiarire l'interazione tra la disregolazione del triptofano e le vie glicolitiche osservate nel presente studio. Il trasportatore di soluti della famiglia 7 membro 5 (SLC7A5) è noto per essere un trasportatore di triptofano43,44,45. La chinolinico acido fosforibosiltransferasi (QPRT) è un enzima situato a valle della via della chinurenina che converte l'acido chinolinico in NAMN46. L'ispezione del dataset LUAD TCGA ha rivelato che sia SLC7A5 che QPRT erano significativamente sovraregolati nel tessuto tumorale rispetto al tessuto normale (Fig. 5e). Questo aumento è stato osservato negli stadi I e II, nonché negli stadi III e IV dell'adenocarcinoma polmonare (Figura supplementare 11), indicando disturbi precoci nel metabolismo del triptofano associati alla tumorigenesi.
Inoltre, il dataset LUAD-TCGA ha mostrato una correlazione positiva tra SLC7A5 e l'espressione di mRNA di GAPDH nei campioni di pazienti affetti da cancro (r = 0,45, p = 1,55E-26, Figura 5f). Al contrario, non è stata trovata alcuna correlazione significativa tra tali firme geniche nel tessuto polmonare normale (r = 0,25, p = 0,06, Figura 5f). Il silenziamento di SLC7A5 (Figura supplementare 12) nelle cellule A549 ha ridotto significativamente i livelli cellulari di triptofano e NAD(H) (Figura 5g,h), con conseguente attenuazione dell'attività glicolitica misurata dal tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) (Figura 1). 5i). Pertanto, sulla base dei cambiamenti metabolici nel siero e del rilevamento in vitro, ipotizziamo che il metabolismo del triptofano possa produrre NAD+ attraverso la via della chinurenina e svolgere un ruolo importante nel promuovere la glicolisi nel cancro del polmone.
Studi hanno dimostrato che un elevato numero di noduli polmonari indeterminati rilevati mediante LDCT può comportare la necessità di ulteriori test, come PET-CT, biopsia polmonare e sovratrattamento a causa di una diagnosi falsamente positiva di malignità.31 Come mostrato nella Figura 6, il nostro studio ha identificato un pannello di metaboliti sierici con potenziale valore diagnostico che potrebbe migliorare la stratificazione del rischio e la successiva gestione dei noduli polmonari rilevati mediante TC.
I noduli polmonari vengono valutati mediante tomografia computerizzata a bassa dose (LDCT), le cui caratteristiche di imaging suggeriscono cause benigne o maligne. L'esito incerto dei noduli può portare a frequenti visite di controllo, interventi non necessari e sovratrattamento. L'inclusione di classificatori metabolici sierici con valore diagnostico può migliorare la valutazione del rischio e la successiva gestione dei noduli polmonari. PET (tomografia a emissione di positroni).
I dati dello studio statunitense NLST e dello studio europeo NELSON suggeriscono che lo screening dei gruppi ad alto rischio con tomografia computerizzata a bassa dose (LDCT) potrebbe ridurre la mortalità per cancro al polmone1,3. Tuttavia, la valutazione del rischio e la successiva gestione clinica di un elevato numero di noduli polmonari incidentali rilevati tramite LDCT rimangono le sfide più complesse. L'obiettivo principale è ottimizzare la corretta classificazione dei protocolli basati su LDCT esistenti, integrando biomarcatori affidabili.
Alcuni biomarcatori molecolari, come i metaboliti ematici, sono stati identificati confrontando il cancro al polmone con controlli sani15,17. Nel presente studio, ci siamo concentrati sull'applicazione dell'analisi metabolomica del siero per distinguere tra noduli polmonari benigni e maligni rilevati incidentalmente mediante LDCT. Abbiamo confrontato il metaboloma sierico globale di campioni di controllo sani (HC), noduli polmonari benigni (BN) e adenocarcinoma polmonare di stadio I (LA) utilizzando l'analisi UPLC-HRMS. Abbiamo scoperto che HC e BN avevano profili metabolici simili, mentre LA mostrava cambiamenti significativi rispetto a HC e BN. Abbiamo identificato due gruppi di metaboliti sierici che differenziano LA da HC e BN.
L'attuale schema di identificazione dei noduli benigni e maligni basato sulla TC a bassa dose si fonda principalmente sulle dimensioni, la densità, la morfologia e il tasso di crescita dei noduli nel tempo30. Studi precedenti hanno dimostrato che le dimensioni dei noduli sono strettamente correlate alla probabilità di cancro al polmone. Anche nei pazienti ad alto rischio, il rischio di malignità nei noduli <6 mm è <1%. Il rischio di malignità per i noduli di dimensioni comprese tra 6 e 20 mm varia dall'8% al 64%30. Pertanto, la Fleischner Society raccomanda un diametro di cutoff di 6 mm per il follow-up TC di routine.29 Tuttavia, la valutazione del rischio e la gestione dei noduli polmonari indeterminati (IPN) di dimensioni superiori a 6 mm non sono state eseguite in modo adeguato31. L'attuale gestione delle cardiopatie congenite si basa solitamente sull'attesa vigile con frequenti controlli TC.
Sulla base del metaboloma validato, abbiamo dimostrato per la prima volta la sovrapposizione delle firme metabolomiche tra individui sani e noduli benigni <6 mm. La somiglianza biologica è coerente con precedenti riscontri TC secondo cui il rischio di malignità per i noduli <6 mm è basso quanto per i soggetti senza noduli.30 Va notato che i nostri risultati dimostrano anche che i noduli benigni <6 mm e ≥6 mm presentano un'elevata somiglianza nei profili metabolomici, suggerendo che la definizione funzionale di eziologia benigna è coerente indipendentemente dalle dimensioni del nodulo. Pertanto, i moderni pannelli di metaboliti sierici diagnostici possono fornire un singolo test come test di esclusione quando i noduli vengono inizialmente rilevati alla TC e potenzialmente ridurre il monitoraggio seriale. Allo stesso tempo, lo stesso pannello di biomarcatori metabolici ha distinto i noduli maligni di dimensioni ≥6 mm dai noduli benigni e ha fornito previsioni accurate per IPN di dimensioni simili e caratteristiche morfologiche ambigue nelle immagini TC. Questo classificatore del metabolismo sierico ha mostrato buone prestazioni nel predire la malignità dei noduli ≥6 mm con un'AUC di 0,927. Nel complesso, i nostri risultati indicano che specifiche firme metabolomiche sieriche possono riflettere in modo specifico le alterazioni metaboliche precoci indotte dal tumore e avere un potenziale valore come predittori di rischio, indipendentemente dalle dimensioni del nodulo.
In particolare, l'adenocarcinoma polmonare (LUAD) e il carcinoma a cellule squamose (LUSC) sono i principali tipi di carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC). Dato che il LUSC è fortemente associato all'uso di tabacco47 e il LUAD è l'istologia più comune dei noduli polmonari incidentali rilevati durante lo screening con TC48, il nostro modello di classificazione è stato specificamente costruito per campioni di adenocarcinoma in stadio I. Wang e colleghi si sono concentrati anche sul LUAD e hanno identificato nove firme lipidiche utilizzando la lipidomica per distinguere il carcinoma polmonare in fase iniziale dagli individui sani17. Abbiamo testato l'attuale modello di classificazione su 16 casi di LUSC in stadio I e 74 noduli benigni e abbiamo osservato una bassa accuratezza di previsione del LUSC (AUC 0,776), suggerendo che LUAD e LUSC potrebbero avere le proprie firme metabolomiche. Infatti, è stato dimostrato che LUAD e LUSC differiscono per eziologia, origine biologica e aberrazioni genetiche49. Pertanto, altri tipi di istologia dovrebbero essere inclusi nei modelli di addestramento per la rilevazione del carcinoma polmonare su base di popolazione nei programmi di screening.
Qui abbiamo identificato i sei percorsi metabolici più frequentemente alterati nell'adenocarcinoma polmonare rispetto ai controlli sani e ai noduli benigni. La xantina e l'ipoxantina sono metaboliti comuni del percorso metabolico delle purine. In linea con i nostri risultati, gli intermedi associati al metabolismo delle purine erano significativamente aumentati nel siero o nei tessuti di pazienti con adenocarcinoma polmonare rispetto ai controlli sani o ai pazienti allo stadio preinvasivo15,50. Livelli elevati di xantina e ipoxantina nel siero possono riflettere l'anabolismo richiesto dalle cellule tumorali in rapida proliferazione. La disregolazione del metabolismo del glucosio è un segno distintivo ben noto del metabolismo del cancro51. Qui abbiamo osservato un aumento significativo di piruvato e lattato nel gruppo LA rispetto ai gruppi HC e BN, il che è coerente con precedenti rapporti di anomalie del percorso glicolitico nei profili del metaboloma sierico di pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) e controlli sani. I risultati sono coerenti52,53.
È importante notare che abbiamo osservato una correlazione inversa tra il metabolismo del piruvato e del triptofano nel siero degli adenocarcinomi polmonari. I livelli sierici di triptofano erano ridotti nel gruppo LA rispetto al gruppo HC o BN. È interessante notare che un precedente studio su larga scala condotto su una coorte prospettica ha rilevato che bassi livelli di triptofano circolante erano associati a un aumento del rischio di cancro al polmone 54. Il triptofano è un aminoacido essenziale che otteniamo interamente dagli alimenti. Concludiamo che la deplezione di triptofano nel siero degli adenocarcinomi polmonari potrebbe riflettere un rapido esaurimento di questo metabolita. È noto che il prodotto finale del catabolismo del triptofano attraverso la via della chinurenina è la fonte della sintesi de novo di NAD+. Poiché il NAD+ viene prodotto principalmente attraverso la via di recupero, l'importanza del NAD+ nel metabolismo del triptofano in condizioni di salute e malattia deve ancora essere determinata46. La nostra analisi del database TCGA ha mostrato che l'espressione del trasportatore di triptofano solute transporter 7A5 (SLC7A5) era significativamente aumentata nell'adenocarcinoma polmonare rispetto ai controlli normali ed era correlata positivamente con l'espressione dell'enzima glicolitico GAPDH. Studi precedenti si sono concentrati principalmente sul ruolo del catabolismo del triptofano nella soppressione della risposta immunitaria antitumorale40,41,42. Qui dimostriamo che l'inibizione dell'assorbimento di triptofano mediante il silenziamento di SLC7A5 nelle cellule tumorali polmonari determina una successiva diminuzione dei livelli cellulari di NAD e una concomitante attenuazione dell'attività glicolitica. In sintesi, il nostro studio fornisce una base biologica per le modifiche del metabolismo sierico associate alla trasformazione maligna dell'adenocarcinoma polmonare.
Le mutazioni dell'EGFR sono le mutazioni driver più comuni nei pazienti con NSCLC. Nel nostro studio, abbiamo scoperto che i pazienti con mutazione dell'EGFR (n = 41) avevano profili metabolomici complessivi simili a quelli dei pazienti con EGFR wild-type (n = 31), sebbene abbiamo riscontrato livelli sierici ridotti di acilcarnitine in alcuni pazienti con mutazione dell'EGFR. La funzione nota delle acilcarnitine è quella di trasportare i gruppi acilici dal citoplasma alla matrice mitocondriale, portando all'ossidazione degli acidi grassi per produrre energia 55. In linea con i nostri risultati, un recente studio ha anche identificato profili metabolomici simili tra tumori con mutazione dell'EGFR e tumori con EGFR wild-type analizzando il metaboloma globale di 102 campioni di tessuto di adenocarcinoma polmonare50. È interessante notare che il contenuto di acilcarnitine è stato riscontrato anche nel gruppo con mutazione dell'EGFR. Pertanto, potrebbe essere opportuno approfondire se le variazioni dei livelli di acilcarnitina riflettano cambiamenti metabolici indotti dall'EGFR e quali siano i meccanismi molecolari sottostanti.
In conclusione, il nostro studio definisce un classificatore metabolico sierico per la diagnosi differenziale dei noduli polmonari e propone un flusso di lavoro in grado di ottimizzare la valutazione del rischio e facilitare la gestione clinica basata sullo screening mediante tomografia computerizzata (TC).
Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Oncologico dell'Università Sun Yat-sen, del Primo Ospedale Affiliato dell'Università Sun Yat-sen e dal Comitato Etico dell'Ospedale Oncologico dell'Università di Zhengzhou. Nei gruppi di scoperta e validazione interna, sono stati raccolti 174 sieri da individui sani e 244 sieri da noduli benigni da individui sottoposti a esami medici annuali presso il Dipartimento di Controllo e Prevenzione del Cancro del Centro Oncologico dell'Università Sun Yat-sen, e 166 sieri da noduli benigni. Gli adenocarcinomi polmonari di stadio I sono stati raccolti dal Centro Oncologico dell'Università Sun Yat-sen. Nella coorte di validazione esterna, c'erano 48 casi di noduli benigni, 39 casi di adenocarcinoma polmonare di stadio I dal Primo Ospedale Affiliato dell'Università Sun Yat-sen e 24 casi di adenocarcinoma polmonare di stadio I dall'Ospedale Oncologico di Zhengzhou. Il Centro Oncologico dell'Università Sun Yat-sen ha inoltre raccolto 16 casi di carcinoma polmonare a cellule squamose di stadio I per testare la capacità diagnostica del classificatore metabolico stabilito (le caratteristiche dei pazienti sono riportate nella Tabella supplementare 5). I campioni della coorte di scoperta e della coorte di validazione interna sono stati raccolti tra gennaio 2018 e maggio 2020. I campioni per la coorte di validazione esterna sono stati raccolti tra agosto 2021 e ottobre 2022. Per minimizzare il bias di genere, a ciascuna coorte è stato assegnato un numero approssimativamente uguale di casi maschili e femminili. Team di scoperta e Team di revisione interna. Il genere dei partecipanti è stato determinato in base all'autodichiarazione. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti e non è stato fornito alcun compenso. I soggetti con noduli benigni erano quelli con un punteggio TC stabile a 2-5 anni al momento dell'analisi, ad eccezione di 1 caso dal campione di validazione esterna, che è stato raccolto preoperatoriamente e diagnosticato mediante istopatologia. Con l'eccezione della bronchite cronica. I casi di adenocarcinoma polmonare sono stati raccolti prima della resezione polmonare e confermati mediante diagnosi patologica. Campioni di sangue a digiuno sono stati raccolti in provette per la separazione del siero senza anticoagulanti. I campioni di sangue sono stati lasciati coagulare per 1 ora a temperatura ambiente e quindi centrifugati a 2851 × g per 10 minuti a 4 °C per raccogliere il supernatante del siero. Aliquote di siero sono state congelate a -80 °C fino all'estrazione dei metaboliti. Il Dipartimento di Prevenzione del Cancro e di Esami Medici del Centro Oncologico dell'Università Sun Yat-sen ha raccolto un pool di siero da 100 donatori sani, comprendente un numero uguale di uomini e donne di età compresa tra 40 e 55 anni. Volumi uguali di ciascun campione di donatore sono stati miscelati, il pool risultante è stato aliquota e conservato a -80 °C. La miscela di siero è stata utilizzata come materiale di riferimento per il controllo di qualità e la standardizzazione dei dati.
Il siero di riferimento e i campioni di prova sono stati scongelati e i metaboliti sono stati estratti utilizzando un metodo di estrazione combinato (MTBE/metanolo/acqua) 56. In breve, 50 μl di siero sono stati miscelati con 225 μl di metanolo ghiacciato e 750 μl di metil tert-butil etere (MTBE) ghiacciato. Mescolare la miscela e incubare sul ghiaccio per 1 ora. I campioni sono stati quindi miscelati e vortexati con 188 μl di acqua di grado MS contenente standard interni (13C-lattato, 13C3-piruvato, 13C-metionina e 13C6-isoleucina, acquistati da Cambridge Isotope Laboratories). La miscela è stata quindi centrifugata a 15.000 × g per 10 min a 4 °C e la fase inferiore è stata trasferita in due provette (125 μL ciascuna) per l'analisi LC-MS in modalità positiva e negativa. Infine, il campione è stato fatto evaporare fino a completa secchezza in un concentratore sottovuoto ad alta velocità.
I metaboliti essiccati sono stati ricostituiti in 120 μl di acetonitrile all'80%, agitati al vortex per 5 minuti e centrifugati a 15.000 × g per 10 minuti a 4 °C. I surnatanti sono stati trasferiti in fiale di vetro ambrato con microinserti per studi di metabolomica. Analisi metabolomica non mirata su una piattaforma di cromatografia liquida ad altissime prestazioni-spettrometria di massa ad alta risoluzione (UPLC-HRMS). I metaboliti sono stati separati utilizzando un sistema UPLC Dionex Ultimate 3000 e una colonna ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). In modalità ioni positivi, le fasi mobili erano acetonitrile al 95% (A) e al 50% (B), ciascuna contenente 10 mmol/L di acetato di ammonio e 0,1% di acido formico. In modalità negativa, le fasi mobili A e B contenevano rispettivamente il 95% e il 50% di acetonitrile, entrambe le fasi contenevano 10 mmol/L di acetato di ammonio, pH = 9. Il programma di gradiente era il seguente: 0–0,5 min, 2% B; 0,5–12 min, 2–50% B; 12–14 min, 50–98% B; 14–16 min, 98% B; 16–16,1 min, 98–2% B; 16,1–20 min, 2% B. La colonna è stata mantenuta a 40 °C e il campione a 10 °C nell'autocampionatore. La velocità di flusso era di 0,3 ml/min, il volume di iniezione era di 3 μl. Uno spettrometro di massa Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) con sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI) è stato utilizzato in modalità full scan e accoppiato alla modalità di monitoraggio ddMS2 per raccogliere grandi volumi di dati. I parametri MS sono stati impostati come segue: tensione di spruzzo +3,8 kV/- 3,2 kV, temperatura del capillare 320 °C, gas di protezione 40 arb, gas ausiliario 10 arb, temperatura del riscaldatore della sonda 350 °C, intervallo di scansione 70–1050 m/h, risoluzione 70 000. I dati sono stati acquisiti utilizzando Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Per valutare la qualità dei dati, sono stati generati campioni di controllo qualità (QC) raggruppati prelevando aliquote di 10 μL del surnatante da ciascun campione. Sei iniezioni di campioni di controllo qualità sono state analizzate all'inizio della sequenza analitica per valutare la stabilità del sistema UPLC-MS. I campioni di controllo qualità vengono quindi introdotti periodicamente nel batch. Tutti gli 11 batch di campioni di siero in questo studio sono stati analizzati mediante LC-MS. Aliquote di una miscela di pool di siero proveniente da 100 donatori sani sono state utilizzate come materiale di riferimento nei rispettivi batch per monitorare il processo di estrazione e compensare gli effetti batch-to-batch. L'analisi metabolomica non mirata della coorte di scoperta, della coorte di validazione interna e della coorte di validazione esterna è stata eseguita presso il Centro di Metabolomica dell'Università Sun Yat-sen. Il laboratorio esterno del Centro di Analisi e Test dell'Università di Tecnologia del Guangdong ha inoltre analizzato 40 campioni della coorte esterna per testare le prestazioni del modello di classificazione.
Dopo l'estrazione e la ricostituzione, la quantificazione assoluta dei metaboliti sierici è stata misurata mediante cromatografia liquida ad altissima prestazione accoppiata a spettrometria di massa tandem (Agilent 6495 a triplo quadrupolo) con sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI) in modalità di monitoraggio di reazione multipla (MRM). Per la separazione dei metaboliti è stata utilizzata una colonna ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). La fase mobile era costituita da acetonitrile al 90% (A) e al 5% (B) con acetato di ammonio 10 mmol/L e soluzione di ammoniaca allo 0,1%. Il programma di gradiente era il seguente: 0–1,5 min, 0% B; 1,5–6,5 min, 0–15% B; 6,5–8 min, 15% B; 8–8,5 min, 15%–0% B; 8,5–11,5 min, 0% B. La colonna è stata mantenuta a 40 °C e il campione a 10 °C nell'autocampionatore. La velocità di flusso era di 0,3 mL/min e il volume di iniezione era di 1 μL. I parametri MS sono stati impostati come segue: tensione capillare ±3,5 kV, pressione del nebulizzatore 35 psi, flusso del gas di rivestimento 12 L/min, temperatura del gas di rivestimento 350 °C, temperatura del gas di essiccazione 250 °C e flusso del gas di essiccazione 14 l/min. Le conversioni MRM di triptofano, piruvato, lattato, ipoxantina e xantina erano rispettivamente 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 e 151,0–107,9. I dati sono stati raccolti utilizzando Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Nei campioni di siero, triptofano, piruvato, lattato, ipoxantina e xantina sono stati quantificati utilizzando curve di calibrazione di soluzioni standard. Nei campioni cellulari, il contenuto di triptofano è stato normalizzato rispetto allo standard interno e alla massa proteica cellulare.
L'estrazione dei picchi (m/z e tempo di ritenzione (RT)) è stata eseguita utilizzando Compound Discovery 3.1 e TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Per eliminare le potenziali differenze tra i lotti, ogni picco caratteristico del campione di prova è stato diviso per il picco caratteristico del materiale di riferimento dello stesso lotto per ottenere l'abbondanza relativa. Le deviazioni standard relative degli standard interni prima e dopo la standardizzazione sono mostrate nella Tabella supplementare 6. Le differenze tra i due gruppi sono state caratterizzate dal tasso di falsa scoperta (FDR < 0,05, test di Wilcoxon sui ranghi con segno) e dal fold change (> 1,2 o < 0,83). I dati MS grezzi delle caratteristiche estratte e i dati MS corretti per il siero di riferimento sono mostrati rispettivamente nei Dati supplementari 1 e nei Dati supplementari 2. L'annotazione dei picchi è stata eseguita sulla base di quattro livelli definiti di identificazione, inclusi metaboliti identificati, composti presumibilmente annotati, classi di composti presumibilmente caratterizzate e composti sconosciuti 22. Sulla base delle ricerche nei database di Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), i composti biologici con standard validati corrispondenti MS/MS o annotazioni di corrispondenza esatta in mzCloud (punteggio > 85) o Chemspider sono stati infine selezionati come intermedi tra il metaboloma differenziale. Le annotazioni dei picchi per ciascuna caratteristica sono incluse nei Dati supplementari 3. MetaboAnalyst 5.0 è stato utilizzato per l'analisi univariata dell'abbondanza di metaboliti normalizzata per somma. MetaboAnalyst 5.0 ha anche valutato l'analisi di arricchimento del pathway KEGG basata sui metaboliti significativamente diversi. L'analisi delle componenti principali (PCA) e l'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali (PLS-DA) sono state analizzate utilizzando il pacchetto software ropls (v.1.26.4) con normalizzazione dello stack e autoscaling. Il modello ottimale di biomarcatore metabolico per la previsione della malignità del nodulo è stato generato utilizzando la regressione logistica binaria con operatore di contrazione e selezione minimo assoluto (LASSO, pacchetto R v.4.1-3). Le prestazioni del modello discriminante nei set di rilevamento e validazione sono state caratterizzate stimando l'AUC sulla base dell'analisi ROC secondo il pacchetto pROC (v.1.18.0). La soglia di probabilità ottimale è stata ottenuta in base al massimo indice di Youden del modello (sensibilità + specificità – 1). I campioni con valori inferiori o superiori alla soglia saranno classificati rispettivamente come noduli benigni e adenocarcinoma polmonare.
Le cellule A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) sono state coltivate in terreno F-12K contenente il 10% di FBS. Sequenze di RNA a forcina corta (shRNA) mirate a SLC7A5 e un controllo non mirato (NC) sono state inserite nel vettore lentivirale pLKO.1-puro. Le sequenze antisenso di shSLC7A5 sono le seguenti: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Gli anticorpi anti-SLC7A5 (#5347) e anti-tubulina (#2148) sono stati acquistati da Cell Signaling Technology. Gli anticorpi anti-SLC7A5 e anti-tubulina sono stati utilizzati a una diluizione di 1:1000 per l'analisi Western blot.
Il test di stress glicolitico Seahorse XF misura i livelli di acidificazione extracellulare (ECAR). Nel test, glucosio, oligomicina A e 2-DG sono stati somministrati in sequenza per valutare la capacità glicolitica cellulare, misurata tramite l'ECAR.
Le cellule A549 trasfettate con il controllo non mirato (NC) e shSLC7A5 (Sh1, Sh2) sono state piastrate per una notte in piastre di 10 cm di diametro. I metaboliti cellulari sono stati estratti con 1 ml di metanolo acquoso all'80% ghiacciato. Le cellule nella soluzione di metanolo sono state raschiate, raccolte in una nuova provetta e centrifugate a 15.000 × g per 15 minuti a 4°C. Sono stati raccolti 800 µl di surnatante e essiccati utilizzando un concentratore sottovuoto ad alta velocità. I pellet di metaboliti essiccati sono stati quindi analizzati per i livelli di triptofano mediante LC-MS/MS come descritto in precedenza. I livelli cellulari di NAD(H) nelle cellule A549 (NC e shSLC7A5) sono stati misurati utilizzando un kit colorimetrico quantitativo NAD+/NADH (#K337, BioVision) secondo le istruzioni del produttore. I livelli proteici sono stati misurati per ciascun campione per normalizzare la quantità di metaboliti.
Non sono stati utilizzati metodi statistici per determinare preliminarmente la dimensione del campione. Precedenti studi di metabolomica volti alla scoperta di biomarcatori15,18 sono stati considerati come parametri di riferimento per la determinazione della dimensione e, rispetto a questi studi, il nostro campione è risultato adeguato. Nessun campione è stato escluso dalla coorte di studio. I campioni di siero sono stati assegnati in modo casuale a un gruppo di scoperta (306 casi, 74,6%) e a un gruppo di validazione interna (104 casi, 25,4%) per studi di metabolomica non mirata. Abbiamo inoltre selezionato in modo casuale 70 casi da ciascun gruppo del set di scoperta per studi di metabolomica mirata. I ricercatori erano all'oscuro dell'assegnazione al gruppo durante la raccolta e l'analisi dei dati LC-MS. Le analisi statistiche dei dati di metabolomica e degli esperimenti cellulari sono descritte nelle rispettive sezioni Risultati, Didascalie delle figure e Metodi. La quantificazione del triptofano cellulare, del NADT e dell'attività glicolitica è stata eseguita tre volte in modo indipendente con risultati identici.
Per maggiori informazioni sul disegno dello studio, si veda il riassunto del Natural Portfolio Report allegato a questo articolo.
I dati MS grezzi delle caratteristiche estratte e i dati MS normalizzati del siero di riferimento sono mostrati rispettivamente nei Dati supplementari 1 e nei Dati supplementari 2. Le annotazioni dei picchi per le caratteristiche differenziali sono presentate nei Dati supplementari 3. Il dataset LUAD TCGA può essere scaricato da https://portal.gdc.cancer.gov/. I dati di input per la creazione del grafico sono forniti nei dati di origine. I dati di origine sono forniti per questo articolo.
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Data di pubblicazione: 18 settembre 2023