La diagnosi differenziale dei noduli polmonari identificati mediante tomografia computerizzata (TC) rimane una sfida nella pratica clinica.Qui, caratterizziamo il metaboloma globale di 480 campioni di siero, inclusi controlli sani, noduli polmonari benigni e adenocarcinoma polmonare di stadio I.Gli adenocarcinomi mostrano profili metabolomici unici, mentre i noduli benigni e gli individui sani hanno un'elevata somiglianza nei profili metabolomici.Nel gruppo di scoperta (n = 306), è stato identificato un set di 27 metaboliti per differenziare tra noduli benigni e maligni.L'AUC del modello discriminante nei gruppi di validazione interna (n = 104) e di validazione esterna (n = 111) era rispettivamente 0,915 e 0,945.L'analisi del percorso ha rivelato un aumento dei metaboliti glicolitici associati a una diminuzione del triptofano nel siero dell'adenocarcinoma polmonare rispetto ai noduli benigni e ai controlli sani e ha suggerito che l'assorbimento del triptofano promuove la glicolisi nelle cellule di cancro del polmone.Il nostro studio evidenzia il valore dei biomarcatori dei metaboliti sierici nella valutazione del rischio di noduli polmonari rilevati dalla TC.
La diagnosi precoce è fondamentale per migliorare i tassi di sopravvivenza dei pazienti affetti da cancro.I risultati del National Lung Cancer Screening Trial (NLST) statunitense e dello studio europeo NELSON hanno dimostrato che lo screening con tomografia computerizzata a basso dosaggio (LDCT) può ridurre significativamente la mortalità per cancro del polmone nei gruppi ad alto rischio1,2,3.Dall'uso diffuso della LDCT per lo screening del cancro del polmone, l'incidenza di reperti radiografici incidentali di noduli polmonari asintomatici ha continuato ad aumentare4.I noduli polmonari sono definiti come opacità focali fino a 3 cm di diametro5.Ci troviamo di fronte a difficoltà nel valutare la probabilità di malignità e nel gestire il gran numero di noduli polmonari rilevati incidentalmente all'LDCT.Le limitazioni della TC possono portare a frequenti esami di follow-up e risultati falsi positivi, portando a interventi non necessari e a trattamenti eccessivi6.Pertanto, è necessario sviluppare biomarcatori affidabili e utili per identificare correttamente il cancro del polmone nelle fasi iniziali e differenziare la maggior parte dei noduli benigni al momento della diagnosi iniziale 7 .
L'analisi molecolare completa del sangue (siero, plasma, cellule mononucleate del sangue periferico), compresa la genomica, la proteomica o la metilazione del DNA8,9,10, ha portato a un crescente interesse per la scoperta di biomarcatori diagnostici per il cancro del polmone.Nel frattempo, gli approcci metabolomici misurano i prodotti finali cellulari che sono influenzati da azioni endogene ed esogene e vengono quindi applicati per prevedere l’insorgenza e l’esito della malattia.La cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS) è un metodo ampiamente utilizzato per gli studi di metabolomica grazie alla sua elevata sensibilità e all'ampio intervallo dinamico, che può coprire metaboliti con diverse proprietà fisico-chimiche11,12,13.Sebbene l'analisi metabolomica globale del plasma/siero sia stata utilizzata per identificare i biomarcatori associati alla diagnosi del cancro del polmone14,15,16,17 e all'efficacia del trattamento,18 i classificatori dei metaboliti sierici per distinguere tra noduli polmonari benigni e maligni rimangono ancora molto studiati.-ricerca massiccia.
L'adenocarcinoma e il carcinoma a cellule squamose sono i due principali sottotipi di cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC).Vari test di screening TC indicano che l'adenocarcinoma è il tipo istologico più comune di cancro del polmone1,19,20,21.In questo studio, abbiamo utilizzato la cromatografia liquida ad alte prestazioni e la spettrometria di massa ad alta risoluzione (UPLC-HRMS) per eseguire analisi metabolomiche su un totale di 695 campioni di siero, inclusi controlli sani, noduli polmonari benigni e ≤3 cm rilevati tramite CT.Screening per adenocarcinoma polmonare in stadio I.Abbiamo identificato un pannello di metaboliti sierici che distinguono l'adenocarcinoma polmonare dai noduli benigni e dai controlli sani.L'analisi dell'arricchimento del percorso ha rivelato che il triptofano anormale e il metabolismo del glucosio sono alterazioni comuni nell'adenocarcinoma polmonare rispetto ai noduli benigni e ai controlli sani.Infine, abbiamo creato e convalidato un classificatore metabolico sierico con elevata specificità e sensibilità per distinguere tra noduli polmonari maligni e benigni rilevati mediante LDCT, che può aiutare nella diagnosi differenziale precoce e nella valutazione del rischio.
Nel presente studio, campioni di siero corrispondenti per sesso ed età sono stati raccolti retrospettivamente da 174 controlli sani, 292 pazienti con noduli polmonari benigni e 229 pazienti con adenocarcinoma polmonare di stadio I.Le caratteristiche demografiche dei 695 soggetti sono mostrate nella Tabella Supplementare 1.
Come mostrato nella Figura 1a, presso il Sun Yat-sen University Cancer Center sono stati raccolti un totale di 480 campioni di siero, inclusi 174 controlli sani (HC), 170 noduli benigni (BN) e 136 campioni di adenocarcinoma polmonare (LA) di stadio I.Coorte di scoperta per la profilazione metabolomica non mirata utilizzando cromatografia liquida ad alte prestazioni e spettrometria di massa ad alta risoluzione (UPLC-HRMS).Come mostrato nella Figura 1 supplementare, sono stati identificati metaboliti differenziali tra LA e HC, LA e BN per stabilire un modello di classificazione ed esplorare ulteriormente l'analisi del percorso differenziale.104 campioni raccolti dal Sun Yat-sen University Cancer Center e 111 campioni raccolti da altri due ospedali sono stati sottoposti rispettivamente a convalida interna ed esterna.
a Popolazione di studio nella coorte di scoperta sottoposta ad analisi metabolomica del siero globale utilizzando cromatografia liquida ad alte prestazioni e spettrometria di massa ad alta risoluzione (UPLC-HRMS).b Analisi discriminante parziale dei minimi quadrati (PLS-DA) del metaboloma totale di 480 campioni di siero dalla coorte di studio, inclusi controlli sani (HC, n = 174), noduli benigni (BN, n = 170) e adenocarcinoma polmonare di stadio I (Los Angeles, n = 136).+ESI, modalità di ionizzazione elettrospray positiva, -ESI, modalità di ionizzazione elettrospray negativa.c – e I metaboliti con abbondanze significativamente diverse in due determinati gruppi (test dei ranghi con segno di Wilcoxon a due code, valore p aggiustato per il tasso di scoperta falsa, FDR <0,05) sono mostrati in rosso (cambiamento di volte> 1,2) e blu (cambiamento di volte <0,83) .) mostrato sul grafico del vulcano.f Mappa termica del clustering gerarchico che mostra differenze significative nel numero di metaboliti annotati tra LA e BN.I dati di origine vengono forniti sotto forma di file di dati di origine.
Il metaboloma sierico totale di 174 HC, 170 BN e 136 LA nel gruppo di scoperta è stato analizzato utilizzando l'analisi UPLC-HRMS.Per prima cosa mostriamo che i campioni di controllo di qualità (QC) si raggruppano strettamente al centro di un modello di analisi dei componenti principali (PCA) non supervisionato, confermando la stabilità delle prestazioni dello studio attuale (Figura 2 supplementare).
Come mostrato nell'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali (PLS-DA) nella Figura 1 b, abbiamo scoperto che c'erano chiare differenze tra LA e BN, LA e HC nelle modalità di ionizzazione elettrospray positiva (+ ESI) e negativa (-ESI) .isolato.Tuttavia, non sono state riscontrate differenze significative tra BN e HC nelle condizioni +ESI e -ESI.
Abbiamo trovato 382 caratteristiche differenziali tra LA e HC, 231 caratteristiche differenziali tra LA e BN e 95 caratteristiche differenziali tra BN e HC (test dei ranghi con segno di Wilcoxon, FDR <0,05 e modifica multipla >1,2 o <0,83) (Figura .1c-e )..I picchi sono stati ulteriormente annotati (Dati supplementari 3) rispetto a un database (libreria mzCloud/HMDB/Chemspider) in base al valore m/z, al tempo di ritenzione e alla ricerca dello spettro di massa di frammentazione (dettagli descritti nella sezione Metodi)22.Infine, sono stati identificati 33 e 38 metaboliti annotati con differenze significative in abbondanza rispettivamente per LA rispetto a BN (Figura 1f e Tabella supplementare 2) e LA rispetto a HC (Figura supplementare 3 e Tabella supplementare 2).Al contrario, solo 3 metaboliti con differenze significative in abbondanza sono stati identificati in BN e HC (Tabella supplementare 2), coerenti con la sovrapposizione tra BN e HC in PLS-DA.Questi metaboliti differenziali coprono un'ampia gamma di sostanze biochimiche (Figura 4 supplementare).Nel loro insieme, questi risultati dimostrano cambiamenti significativi nel metaboloma sierico che riflettono la trasformazione maligna del cancro polmonare in stadio iniziale rispetto ai noduli polmonari benigni o ai soggetti sani.Nel frattempo, la somiglianza del metaboloma sierico di BN e HC suggerisce che i noduli polmonari benigni possono condividere molte caratteristiche biologiche con individui sani.Dato che le mutazioni del gene del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) sono comuni nell'adenocarcinoma polmonare sottotipo 23, abbiamo cercato di determinare l'impatto delle mutazioni del driver sul metaboloma sierico.Abbiamo quindi analizzato il profilo metabolomico complessivo di 72 casi con stato EGFR nel gruppo con adenocarcinoma polmonare.È interessante notare che abbiamo trovato profili comparabili tra pazienti con mutazione EGFR (n = 41) e pazienti con EGFR wild-type (n = 31) nell'analisi PCA (Figura 5a supplementare).Tuttavia, abbiamo identificato 7 metaboliti la cui abbondanza era significativamente alterata nei pazienti con mutazione EGFR rispetto ai pazienti con EGFR wild-type (t test, p <0,05 e fold change > 1,2 o <0,83) (Figura 5b supplementare).La maggior parte di questi metaboliti (5 su 7) sono acilcarnitine, che svolgono un ruolo importante nelle vie di ossidazione degli acidi grassi.
Come illustrato nel flusso di lavoro mostrato nella Figura 2 a, i biomarcatori per la classificazione dei noduli sono stati ottenuti utilizzando gli operatori di contrazione minima assoluta e la selezione basata su 33 metaboliti differenziali identificati in LA (n = 136) e BN (n = 170).Migliore combinazione di variabili (LASSO) – modello di regressione logistica binaria.Per testare l’affidabilità del modello è stata utilizzata una validazione incrociata dieci volte.La selezione delle variabili e la regolarizzazione dei parametri sono regolate da una penalità di massimizzazione della verosimiglianza con il parametro λ24.L'analisi metabolomica globale è stata ulteriormente eseguita in modo indipendente nei gruppi di validazione interna (n = 104) e di validazione esterna (n = 111) per testare le prestazioni di classificazione del modello discriminante.Di conseguenza, 27 metaboliti nel set di scoperta sono stati identificati come il miglior modello discriminante con il valore medio di AUC più grande (Fig. 2b), tra cui 9 avevano un'attività aumentata e 18 un'attività ridotta in LA rispetto a BN (Fig. 2c).
Flusso di lavoro per la creazione di un classificatore di noduli polmonari, inclusa la selezione del miglior pannello di metaboliti sierici nel set di scoperta utilizzando un modello di regressione logistica binaria tramite validazione incrociata dieci volte e la valutazione delle prestazioni predittive in set di validazione interna ed esterna.b Statistiche di convalida incrociata del modello di regressione LASSO per la selezione dei biomarcatori metabolici.I numeri sopra indicati rappresentano il numero medio di biomarcatori selezionati ad un dato λ.La linea tratteggiata rossa rappresenta il valore medio di AUC al corrispondente lambda.Le barre di errore grigie rappresentano i valori AUC minimo e massimo.La linea tratteggiata indica il modello migliore con i 27 biomarcatori selezionati.AUC, area sotto la curva ROC (caratteristica operativa del ricevitore).c Piegare i cambiamenti di 27 metaboliti selezionati nel gruppo LA rispetto al gruppo BN nel gruppo discovery.Colonna rossa – attivazione.La colonna blu è un declino.d – f Curve delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC) che mostrano la potenza del modello discriminante basato su 27 combinazioni di metaboliti nei set di scoperta, convalida interna ed esterna.I dati di origine vengono forniti sotto forma di file di dati di origine.
È stato creato un modello di previsione basato sui coefficienti di regressione ponderati di questi 27 metaboliti (Tabella supplementare 3).L'analisi ROC basata su questi 27 metaboliti ha prodotto un valore dell'area sotto la curva (AUC) di 0,933, la sensibilità del gruppo di scoperta era 0,868 e la specificità era 0,859 (Fig. 2d).Nel frattempo, tra i 38 metaboliti differenziali annotati tra LA e HC, un insieme di 16 metaboliti ha raggiunto un'AUC di 0,902 con una sensibilità di 0,801 e una specificità di 0,856 nel discriminare LA da HC (Figura 6a-c supplementare).Sono stati confrontati anche i valori di AUC basati su diverse soglie di modifica della piega per metaboliti differenziali.Abbiamo scoperto che il modello di classificazione ha ottenuto i migliori risultati nel discriminare tra LA e BN (HC) quando il livello di modifica della piega era impostato su 1,2 rispetto a 1,5 o 2,0 (Figura 7a,b supplementare).Il modello di classificazione, basato su 27 gruppi di metaboliti, è stato ulteriormente convalidato in coorti interne ed esterne.L'AUC era 0,915 (sensibilità 0,867, specificità 0,811) per la validazione interna e 0,945 (sensibilità 0,810, specificità 0,979) per la validazione esterna (Fig. 2e, f).Per valutare l'efficienza interlaboratorio, 40 campioni della coorte esterna sono stati analizzati in un laboratorio esterno come descritto nella sezione Metodi.L'accuratezza della classificazione ha raggiunto un'AUC di 0,925 (Figura 8 supplementare).Poiché il carcinoma polmonare a cellule squamose (LUSC) è il secondo sottotipo più comune di cancro polmonare non a piccole cellule (NSCLC) dopo l'adenocarcinoma polmonare (LUAD), abbiamo anche testato la potenziale utilità convalidata dei profili metabolici.BN e 16 casi di LUSC.L'AUC della discriminazione tra LUSC e BN era 0,776 (Figura supplementare 9), indicando una capacità inferiore rispetto alla discriminazione tra LUAD e BN.
Gli studi hanno dimostrato che la dimensione dei noduli sulle immagini TC è positivamente correlata alla probabilità di malignità e rimane un importante determinante del trattamento dei noduli25,26,27.L'analisi dei dati dell'ampia coorte dello studio di screening NELSON ha mostrato che il rischio di malignità nei soggetti con linfonodi <5 mm era addirittura simile a quello dei soggetti senza linfonodi 28.Pertanto, la dimensione minima che richiede un monitoraggio TC regolare è 5 mm, come raccomandato dalla British Thoracic Society (BTS), e 6 mm, come raccomandato dalla Fleischner Society 29 .Tuttavia, i noduli più grandi di 6 mm e senza evidenti caratteristiche benigne, chiamati noduli polmonari indeterminati (IPN), rimangono una sfida importante nella valutazione e nella gestione nella pratica clinica30,31.Successivamente abbiamo esaminato se la dimensione del nodulo ha influenzato le firme metabolomiche utilizzando campioni raggruppati dalle coorti di scoperta e validazione interna.Concentrandoci su 27 biomarcatori convalidati, abbiamo prima confrontato i profili PCA dei metabolomi HC e BN inferiori a 6 mm.Abbiamo scoperto che la maggior parte dei punti dati per HC e BN si sovrapponevano, dimostrando che i livelli di metaboliti sierici erano simili in entrambi i gruppi (Fig. 3a).Le mappe delle caratteristiche tra diversi intervalli di dimensioni sono rimaste conservate in BN e LA (Fig. 3b, c), mentre è stata osservata una separazione tra noduli maligni e benigni nell'intervallo 6-20 mm (Fig. 3d).Questa coorte aveva un'AUC di 0,927, una specificità di 0,868 e una sensibilità di 0,820 per prevedere la malignità dei noduli che misuravano da 6 a 20 mm (Fig. 3e, f).I nostri risultati mostrano che il classificatore può catturare i cambiamenti metabolici causati dalla trasformazione maligna precoce, indipendentemente dalla dimensione del nodulo.
ad Confronto dei profili PCA tra gruppi specifici basato su un classificatore metabolico di 27 metaboliti.CC e BN < 6 mm.b BN < 6 mm rispetto a BN 6–20 mm.in LA 6–20 mm rispetto a LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm e LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Curva delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC) che mostra le prestazioni discriminanti del modello per noduli di 6–20 mm.f I valori di probabilità sono stati calcolati sulla base del modello di regressione logistica per noduli di 6-20 mm.La linea tratteggiata grigia rappresenta il valore di cutoff ottimale (0,455).I numeri sopra rappresentano la percentuale di casi previsti per Los Angeles.Utilizza il test t di Student a due code.PCA, analisi delle componenti principali.Area AUC sotto la curva.I dati di origine vengono forniti sotto forma di file di dati di origine.
Quattro campioni (di età compresa tra 44 e 61 anni) con dimensioni di noduli polmonari simili (7-9 mm) sono stati ulteriormente selezionati per illustrare le prestazioni del modello di previsione della malignità proposto (Fig. 4a, b).Allo screening iniziale, il Caso 1 si presentava come un nodulo solido con calcificazione, una caratteristica associata alla benignità, mentre il Caso 2 si presentava come un nodulo parzialmente solido indeterminato senza evidenti caratteristiche benigne.Tre cicli di scansioni TC di follow-up hanno mostrato che questi casi sono rimasti stabili per un periodo di 4 anni e sono stati quindi considerati noduli benigni (Fig. 4a).Rispetto alla valutazione clinica delle scansioni TC seriali, l'analisi dei metaboliti sierici a scatto singolo con l'attuale modello di classificazione ha identificato rapidamente e correttamente questi noduli benigni sulla base di vincoli probabilistici (Tabella 1).La Figura 4b nel caso 3 mostra un nodulo con segni di retrazione pleurica, che molto spesso è associato a una patologia maligna32.Il caso 4 si presentava come un nodulo parzialmente solido indeterminato senza evidenza di causa benigna.Tutti questi casi sono stati previsti come maligni secondo il modello di classificazione (Tabella 1).La valutazione dell'adenocarcinoma polmonare è stata dimostrata mediante esame istopatologico dopo intervento chirurgico di resezione polmonare (Fig. 4b).Per il set di validazione esterna, il classificatore metabolico ha previsto con precisione due casi di noduli polmonari indeterminati più grandi di 6 mm (Figura 10 supplementare).
Immagini TC della finestra assiale dei polmoni di due casi di noduli benigni.Nel caso 1, la TC dopo 4 anni mostrava un nodulo solido stabile di 7 mm con calcificazione nel lobo inferiore destro.Nel caso 2, la TC dopo 5 anni ha rivelato un nodulo stabile, parzialmente solido, con un diametro di 7 mm nel lobo superiore destro.b Immagini TC della finestra assiale dei polmoni e corrispondenti studi patologici di due casi di adenocarcinoma in stadio I prima della resezione polmonare.Il caso 3 evidenziava un nodulo del diametro di 8 mm nel lobo superiore destro con retrazione pleurica.Il caso 4 ha rivelato un nodulo a vetro smerigliato parzialmente solido di 9 mm nel lobo superiore sinistro.Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) del tessuto polmonare resecato (barra della scala = 50 μm) che dimostra il modello di crescita acinoso dell'adenocarcinoma polmonare.Le frecce indicano i noduli rilevati sulle immagini TC.Le immagini H&E sono immagini rappresentative di più campi microscopici (>3) esaminati dal patologo.
Nel loro insieme, i nostri risultati dimostrano il potenziale valore dei biomarcatori dei metaboliti sierici nella diagnosi differenziale dei noduli polmonari, che può rappresentare una sfida quando si valuta lo screening TC.
Sulla base di un pannello di metaboliti differenziali convalidato, abbiamo cercato di identificare i correlati biologici dei principali cambiamenti metabolici.L'analisi dell'arricchimento del percorso KEGG effettuata da MetaboAnalyst ha identificato 6 percorsi comuni significativamente alterati tra i due gruppi indicati (LA vs HC e LA vs BN, p aggiustato ≤ 0,001, effetto > 0,01).Questi cambiamenti sono stati caratterizzati da disturbi nel metabolismo del piruvato, nel metabolismo del triptofano, nel metabolismo della niacina e della nicotinamide, nella glicolisi, nel ciclo del TCA e nel metabolismo delle purine (Fig. 5a).Abbiamo quindi eseguito ulteriormente la metabolomica mirata per verificare i principali cambiamenti utilizzando la quantificazione assoluta.Determinazione di metaboliti comuni in percorsi comunemente alterati mediante spettrometria di massa a triplo quadrupolo (QQQ) utilizzando standard di metaboliti autentici.Le caratteristiche demografiche del campione target dello studio di metabolomica sono incluse nella Tabella supplementare 4. Coerentemente con i nostri risultati di metabolomica globale, l'analisi quantitativa ha confermato che ipoxantina e xantina, piruvato e lattato erano aumentati in LA rispetto a BN e HC (Fig. 5b, c, p<0,05).Tuttavia, non sono state riscontrate differenze significative in questi metaboliti tra BN e HC.
Analisi di arricchimento del percorso KEGG di metaboliti significativamente diversi nel gruppo LA rispetto ai gruppi BN e HC.È stato utilizzato un Globaltest a due code e i valori p sono stati aggiustati utilizzando il metodo Holm-Bonferroni (p aggiustato ≤ 0,001 e dimensione dell'effetto > 0,01).b – d Grafici di violino che mostrano i livelli di ipoxantina, xantina, lattato, piruvato e triptofano nel siero HC, BN e LA determinati mediante LC-MS/MS (n = 70 per gruppo).Le linee tratteggiate bianche e nere indicano rispettivamente la mediana e il quartile.e Grafico di violino che mostra l'espressione di mRNA Log2TPM (trascrizioni per milione) normalizzata di SLC7A5 e QPRT nell'adenocarcinoma polmonare (n = 513) rispetto al tessuto polmonare normale (n = 59) nel set di dati LUAD-TCGA.La casella bianca rappresenta l'intervallo interquartile, la linea nera orizzontale al centro rappresenta la mediana e la linea nera verticale che si estende dalla casella rappresenta l'intervallo di confidenza (CI) al 95%.f Grafico di correlazione di Pearson dell'espressione SLC7A5 e GAPDH nell'adenocarcinoma polmonare (n = 513) e nel tessuto polmonare normale (n = 59) nel set di dati TCGA.L'area grigia rappresenta l'IC al 95%.r, coefficiente di correlazione di Pearson.g Livelli cellulari normalizzati di triptofano in cellule A549 trasfettate con controllo shRNA non specifico (NC) e shSLC7A5 (Sh1, Sh2) determinati mediante LC-MS/MS.Viene presentata l'analisi statistica di cinque campioni biologicamente indipendenti in ciascun gruppo.h Livelli cellulari di NADt (NAD totale, inclusi NAD+ e NADH) nelle cellule A549 (NC) e nelle cellule A549 knockdown SLC7A5 (Sh1, Sh2).Viene presentata l'analisi statistica di tre campioni biologicamente indipendenti in ciascun gruppo.i L'attività glicolitica delle cellule A549 prima e dopo il knockdown di SLC7A5 è stata misurata dal tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) (n = 4 campioni biologicamente indipendenti per gruppo).2-DG,2-desossi-D-glucosio.Il test t di Student a due code è stato utilizzato in (b – h).In (g-i), le barre di errore rappresentano la media ± DS, ciascun esperimento è stato eseguito tre volte in modo indipendente e i risultati erano simili.I dati di origine vengono forniti sotto forma di file di dati di origine.
Considerando l’impatto significativo del metabolismo alterato del triptofano nel gruppo LA, abbiamo valutato anche i livelli sierici di triptofano nei gruppi HC, BN e LA utilizzando QQQ.Abbiamo scoperto che il triptofano sierico era ridotto in LA rispetto a HC o BN (p <0,001, Figura 5d), il che è coerente con i risultati precedenti secondo cui i livelli circolanti di triptofano sono inferiori nei pazienti con cancro ai polmoni rispetto ai controlli sani del gruppo di controllo33,34 ,35.Un altro studio che utilizzava il tracciante PET/CT 11C-metil-L-triptofano ha rilevato che il tempo di ritenzione del segnale del triptofano nel tessuto tumorale polmonare era significativamente aumentato rispetto alle lesioni benigne o al tessuto normale36.Ipotizziamo che la diminuzione del triptofano nel siero di LA possa riflettere l'assorbimento attivo del triptofano da parte delle cellule tumorali del polmone.
È anche noto che il prodotto finale della via della chinurenina del catabolismo del triptofano è NAD+37,38, che è un substrato importante per la reazione della gliceraldeide-3-fosfato con l'1,3-bifosfoglicerato nella glicolisi39.Mentre studi precedenti si sono concentrati sul ruolo del catabolismo del triptofano nella regolazione immunitaria, abbiamo cercato di chiarire l’interazione tra la disregolazione del triptofano e le vie glicolitiche osservate nel presente studio.È noto che il membro 5 della famiglia 7 dei trasportatori di soluti (SLC7A5) è un trasportatore del triptofano43,44,45.La fosforibosiltransferasi dell'acido chinolinico (QPRT) è un enzima situato a valle della via della chinurenina che converte l'acido chinolinico in NAMN46.L'ispezione del set di dati LUAD TCGA ha rivelato che sia SLC7A5 che QPRT erano significativamente sovraregolati nel tessuto tumorale rispetto al tessuto normale (Fig. 5e).Questo aumento è stato osservato negli stadi I e II nonché negli stadi III e IV dell'adenocarcinoma polmonare (Figura 11 supplementare), indicando disturbi precoci nel metabolismo del triptofano associato alla tumorigenesi.
Inoltre, il set di dati LUAD-TCGA ha mostrato una correlazione positiva tra l'espressione di mRNA di SLC7A5 e GAPDH nei campioni di pazienti affetti da cancro (r = 0,45, p = 1,55E-26, Figura 5f).Al contrario, non è stata trovata alcuna correlazione significativa tra tali firme genetiche nel tessuto polmonare normale (r = 0,25, p = 0,06, Figura 5f).L'abbattimento di SLC7A5 (Figura 12 supplementare) nelle cellule A549 ha ridotto significativamente i livelli di triptofano cellulare e NAD (H) (Figura 5g, h), con conseguente attività glicolitica attenuata misurata dal tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) (Figura 1).5i).Pertanto, sulla base dei cambiamenti metabolici nel siero e del rilevamento in vitro, ipotizziamo che il metabolismo del triptofano possa produrre NAD+ attraverso la via della chinurenina e svolgere un ruolo importante nel promuovere la glicolisi nel cancro del polmone.
Gli studi hanno dimostrato che un gran numero di noduli polmonari indeterminati rilevati mediante LDCT può portare alla necessità di ulteriori test come PET-CT, biopsia polmonare e trattamento eccessivo a causa di una diagnosi falsa positiva di malignità.31 Come mostrato nella Figura 6, il nostro studio ha identificato un pannello di metaboliti sierici con potenziale valore diagnostico che può migliorare la stratificazione del rischio e la successiva gestione dei noduli polmonari rilevati mediante TC.
I noduli polmonari vengono valutati utilizzando la tomografia computerizzata a basso dosaggio (LDCT) con caratteristiche di imaging suggestive di cause benigne o maligne.L’esito incerto dei noduli può portare a frequenti visite di follow-up, interventi non necessari e trattamenti eccessivi.L’inclusione di classificatori metabolici sierici con valore diagnostico può migliorare la valutazione del rischio e la successiva gestione dei noduli polmonari.Tomografia ad emissione di positroni PET.
I dati dello studio statunitense NLST e dello studio europeo NELSON suggeriscono che lo screening di gruppi ad alto rischio con tomografia computerizzata a basso dosaggio (LDCT) può ridurre la mortalità per cancro del polmone1,3.Tuttavia, la valutazione del rischio e la successiva gestione clinica di un gran numero di noduli polmonari incidentali rilevati mediante LDCT rimangono le più impegnative.L'obiettivo principale è ottimizzare la corretta classificazione dei protocolli esistenti basati su LDCT incorporando biomarcatori affidabili.
Alcuni biomarcatori molecolari, come i metaboliti del sangue, sono stati identificati confrontando il cancro del polmone con controlli sani15,17.Nel presente studio, ci siamo concentrati sull'applicazione dell'analisi metabolomica del siero per distinguere tra noduli polmonari benigni e maligni rilevati incidentalmente mediante LDCT.Abbiamo confrontato il metaboloma sierico globale di campioni di controllo sano (HC), di noduli polmonari benigni (BN) e di adenocarcinoma polmonare (LA) di stadio I utilizzando l'analisi UPLC-HRMS.Abbiamo scoperto che HC e BN avevano profili metabolici simili, mentre LA mostrava cambiamenti significativi rispetto a HC e BN.Abbiamo identificato due serie di metaboliti sierici che differenziano LA da HC e BN.
L'attuale schema di identificazione dei noduli benigni e maligni basato su LDCT si basa principalmente sulla dimensione, densità, morfologia e tasso di crescita dei noduli nel tempo30.Studi precedenti hanno dimostrato che la dimensione dei noduli è strettamente correlata alla probabilità di cancro ai polmoni.Anche nei pazienti ad alto rischio, il rischio di malignità nei linfonodi <6 mm è <1%.Il rischio di malignità per i noduli di dimensioni comprese tra 6 e 20 mm varia dall'8% al 64%30.Pertanto, la Fleischner Society raccomanda un diametro di taglio di 6 mm per il follow-up TC di routine.29 Tuttavia, la valutazione del rischio e la gestione dei noduli polmonari indeterminati (IPN) di dimensioni superiori a 6 mm non sono state eseguite adeguatamente 31 .L'attuale gestione delle cardiopatie congenite si basa solitamente su un'attesa vigile con frequente monitoraggio TC.
Sulla base del metaboloma convalidato, abbiamo dimostrato per la prima volta la sovrapposizione delle firme metabolomiche tra individui sani e noduli benigni <6 mm.La somiglianza biologica è coerente con i precedenti risultati della TC secondo cui il rischio di malignità per i noduli <6 mm è basso quanto per i soggetti senza linfonodi.30 Va notato che i nostri risultati dimostrano anche che i noduli benigni <6 mm e ≥6 mm hanno un'elevata somiglianza nei profili metabolomici, suggerendo che la definizione funzionale dell'eziologia benigna è coerente indipendentemente dalla dimensione del nodulo.Pertanto, i moderni pannelli diagnostici dei metaboliti sierici possono fornire un singolo test come test di esclusione quando i noduli vengono inizialmente rilevati alla TC e potenzialmente ridurre il monitoraggio seriale.Allo stesso tempo, lo stesso pannello di biomarcatori metabolici ha distinto i noduli maligni di dimensioni ≥ 6 mm da noduli benigni e ha fornito previsioni accurate per IPN di dimensioni simili e caratteristiche morfologiche ambigue sulle immagini TC.Questo classificatore del metabolismo sierico ha funzionato bene nel predire la malignità dei noduli ≥ 6 mm con un'AUC di 0,927.Nel loro insieme, i nostri risultati indicano che firme metabolomiche sieriche uniche possono riflettere specificamente i cambiamenti metabolici precoci indotti dal tumore e avere un potenziale valore come predittori di rischio, indipendentemente dalle dimensioni del nodulo.
In particolare, l’adenocarcinoma polmonare (LUAD) e il carcinoma a cellule squamose (LUSC) sono i principali tipi di cancro polmonare non a piccole cellule (NSCLC).Dato che il LUSC è fortemente associato all'uso del tabacco47 e il LUAD è l'istologia più comune dei noduli polmonari incidentali rilevati allo screening TC48, il nostro modello di classificazione è stato creato appositamente per i campioni di adenocarcinoma di stadio I.Wang e colleghi si sono concentrati anche sulla LUAD e hanno identificato nove firme lipidiche utilizzando la lipidomica per distinguere il cancro polmonare in stadio iniziale da individui sani17.Abbiamo testato l'attuale modello di classificazione su 16 casi di LUSC di stadio I e 74 noduli benigni e abbiamo osservato una bassa precisione di previsione del LUSC (AUC 0,776), suggerendo che LUAD e LUSC potrebbero avere le proprie firme metabolomiche.Infatti, è stato dimostrato che LUAD e LUSC differiscono per eziologia, origine biologica e aberrazioni genetiche49.Pertanto, altri tipi di istologia dovrebbero essere inclusi nei modelli di formazione per l’individuazione del cancro del polmone su base di popolazione nei programmi di screening.
Qui, abbiamo identificato i sei percorsi alterati più frequentemente nell'adenocarcinoma polmonare rispetto ai controlli sani e ai noduli benigni.La xantina e l'ipoxantina sono metaboliti comuni della via metabolica delle purine.Coerentemente con i nostri risultati, gli intermedi associati al metabolismo delle purine erano significativamente aumentati nel siero o nei tessuti dei pazienti con adenocarcinoma polmonare rispetto ai controlli sani o ai pazienti in fase preinvasiva15,50.Livelli elevati di xantina e ipoxantina nel siero possono riflettere l’anabolismo richiesto dalle cellule tumorali in rapida proliferazione.La disregolazione del metabolismo del glucosio è un noto segno distintivo del metabolismo del cancro51.Qui, abbiamo osservato un aumento significativo di piruvato e lattato nel gruppo LA rispetto al gruppo HC e BN, il che è coerente con precedenti segnalazioni di anomalie della via glicolitica nei profili del metaboloma sierico di pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) e controlli sani.i risultati sono coerenti52,53.
È importante sottolineare che abbiamo osservato una correlazione inversa tra il metabolismo del piruvato e del triptofano nel siero degli adenocarcinomi polmonari.I livelli sierici di triptofano erano ridotti nel gruppo LA rispetto al gruppo HC o BN.È interessante notare che un precedente studio su larga scala che utilizzava una coorte prospettica ha rilevato che bassi livelli di triptofano circolante erano associati ad un aumento del rischio di cancro ai polmoni 54 .Il triptofano è un amminoacido essenziale che otteniamo interamente dal cibo.Concludiamo che la deplezione sierica del triptofano nell'adenocarcinoma polmonare può riflettere una rapida deplezione di questo metabolita.È noto che il prodotto finale del catabolismo del triptofano attraverso la via della chinurenina è la fonte della sintesi de novo del NAD+.Poiché il NAD+ è prodotto principalmente attraverso la via di salvataggio, resta da determinare l'importanza del NAD+ nel metabolismo del triptofano in salute e in malattia46.La nostra analisi del database TCGA ha mostrato che l'espressione del trasportatore di soluti del trasportatore del triptofano 7A5 (SLC7A5) era significativamente aumentata nell'adenocarcinoma polmonare rispetto ai controlli normali ed era positivamente correlata con l'espressione dell'enzima glicolitico GAPDH.Studi precedenti si sono concentrati principalmente sul ruolo del catabolismo del triptofano nella soppressione della risposta immunitaria antitumorale40,41,42.Qui dimostriamo che l'inibizione dell'assorbimento del triptofano mediante knockdown di SLC7A5 nelle cellule di cancro del polmone determina una successiva diminuzione dei livelli di NAD cellulare e una concomitante attenuazione dell'attività glicolitica.In sintesi, il nostro studio fornisce una base biologica per i cambiamenti nel metabolismo del siero associati alla trasformazione maligna dell’adenocarcinoma polmonare.
Le mutazioni dell'EGFR sono le mutazioni driver più comuni nei pazienti con NSCLC.Nel nostro studio, abbiamo scoperto che i pazienti con mutazione dell'EGFR (n = 41) avevano profili metabolomici complessivi simili ai pazienti con EGFR wild-type (n = 31), sebbene abbiamo riscontrato livelli sierici ridotti di alcuni pazienti con mutazione di EGFR nei pazienti con acilcarnitina.La funzione accertata delle acilcarnitine è quella di trasportare i gruppi acilici dal citoplasma alla matrice mitocondriale, portando all'ossidazione degli acidi grassi per produrre energia 55 .Coerentemente con i nostri risultati, uno studio recente ha anche identificato profili metabolomici simili tra tumori EGFR mutanti e EGFR wild-type analizzando il metaboloma globale di 102 campioni di tessuto di adenocarcinoma polmonare50.È interessante notare che il contenuto di acilcarnitina è stato trovato anche nel gruppo mutante EGFR.Pertanto, se i cambiamenti nei livelli di acilcarnitina riflettono i cambiamenti metabolici indotti dall’EGFR e le vie molecolari sottostanti potrebbero meritare ulteriori studi.
In conclusione, il nostro studio stabilisce un classificatore metabolico sierico per la diagnosi differenziale dei noduli polmonari e propone un flusso di lavoro in grado di ottimizzare la valutazione del rischio e facilitare la gestione clinica basata sullo screening con scansione TC.
Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Oncologico dell'Università di Sun Yat-sen, dal Primo Ospedale Affiliato dell'Università di Sun Yat-sen e dal Comitato Etico dell'Ospedale Oncologico dell'Università di Zhengzhou.Nei gruppi di scoperta e convalida interna, sono stati raccolti 174 sieri di individui sani e 244 sieri di noduli benigni da individui sottoposti a esami medici annuali presso il Dipartimento di controllo e prevenzione del cancro, Sun Yat-sen University Cancer Center e 166 noduli benigni.siero.Gli adenocarcinomi polmonari di stadio I sono stati raccolti dal Sun Yat-sen University Cancer Center.Nella coorte di validazione esterna, c'erano 48 casi di noduli benigni, 39 casi di adenocarcinoma polmonare di stadio I del Primo Ospedale Affiliato dell'Università Sun Yat-sen e 24 casi di adenocarcinoma polmonare di stadio I del Zhengzhou Cancer Hospital.Il Sun Yat-sen University Cancer Center ha anche raccolto 16 casi di cancro polmonare a cellule squamose in stadio I per testare la capacità diagnostica del classificatore metabolico stabilito (le caratteristiche dei pazienti sono mostrate nella Tabella supplementare 5).I campioni della coorte di scoperta e della coorte di validazione interna sono stati raccolti tra gennaio 2018 e maggio 2020. I campioni per la coorte di validazione esterna sono stati raccolti tra agosto 2021 e ottobre 2022. Per ridurre al minimo i pregiudizi di genere, a ciascuna è stato assegnato un numero approssimativamente uguale di casi maschili e femminili coorte.Team di scoperta e team di revisione interna.Il sesso dei partecipanti è stato determinato sulla base dell'autovalutazione.È stato ottenuto il consenso informato di tutti i partecipanti e non è stato previsto alcun compenso.I soggetti con noduli benigni erano quelli con un punteggio TC stabile da 2 a 5 anni al momento dell'analisi, ad eccezione di 1 caso dal campione di validazione esterno, che è stato raccolto prima dell'intervento e diagnosticato mediante istopatologia.Ad eccezione della bronchite cronica.I casi di adenocarcinoma polmonare sono stati raccolti prima della resezione polmonare e confermati dalla diagnosi patologica.I campioni di sangue a digiuno sono stati raccolti in provette per la separazione del siero senza anticoagulanti.I campioni di sangue sono stati coagulati per 1 ora a temperatura ambiente e poi centrifugati a 2851 × g per 10 minuti a 4°C per raccogliere il surnatante del siero.Aliquote di siero sono state congelate a -80°C fino all'estrazione del metabolita.Il Dipartimento di prevenzione del cancro e visita medica del Centro oncologico dell’Università Sun Yat-sen ha raccolto un pool di siero da 100 donatori sani, tra cui un uguale numero di uomini e donne di età compresa tra 40 e 55 anni.Volumi uguali di ciascun campione di donatore sono stati miscelati, il pool risultante è stato suddiviso in aliquote e conservato a -80°C.La miscela di siero è stata utilizzata come materiale di riferimento per il controllo di qualità e la standardizzazione dei dati.
Il siero di riferimento e i campioni da analizzare sono stati scongelati e i metaboliti sono stati estratti utilizzando un metodo di estrazione combinato (MTBE/metanolo/acqua) 56 .In breve, 50 μl di siero sono stati miscelati con 225 μl di metanolo ghiacciato e 750 μl di metil tert-butile etere ghiacciato (MTBE).Mescolare la miscela e incubare in ghiaccio per 1 ora.I campioni sono stati quindi miscelati e miscelati su vortex con 188 μl di acqua di grado MS contenente standard interni (13C-lattato, 13C3-piruvato, 13C-metionina e 13C6-isoleucina, acquistati dai Cambridge Isotope Laboratories).La miscela è stata quindi centrifugata a 15.000 × g per 10 minuti a 4 °C e la fase inferiore è stata trasferita in due provette (da 125 μL ciascuna) per l'analisi LC-MS in modalità positiva e negativa.Infine, il campione è stato evaporato a secchezza in un concentratore sotto vuoto ad alta velocità.
I metaboliti essiccati sono stati ricostituiti in 120 μl di acetonitrile all'80%, agitati su vortex per 5 minuti e centrifugati a 15.000 × g per 10 minuti a 4°C.I surnatanti sono stati trasferiti in fiale di vetro ambrato con microinserti per studi di metabolomica.Analisi metabolomica non mirata su una piattaforma di cromatografia liquida ad alte prestazioni e spettrometria di massa ad alta risoluzione (UPLC-HRMS).I metaboliti sono stati separati utilizzando un sistema Dionex Ultimate 3000 UPLC e una colonna ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters).Nella modalità con ioni positivi, le fasi mobili erano costituite dal 95% (A) e dal 50% di acetonitrile (B), ciascuna contenente 10 mmol/L di acetato di ammonio e 0,1% di acido formico.In modalità negativa, le fasi mobili A e B contenevano rispettivamente il 95% e il 50% di acetonitrile, entrambe le fasi contenevano 10 mmol/L di acetato di ammonio, pH = 9. Il programma del gradiente era il seguente: 0–0,5 min, 2% B;0,5–12 minuti, 2–50% B;12–14 minuti, 50–98% B;14-16 minuti, 98% B;16–16.1.min, 98 –2% B;16,1–20 min, 2% B. La colonna è stata mantenuta a 40°C e il campione a 10°C nell'autocampionatore.La portata era di 0,3 ml/min, il volume di iniezione era di 3 μl.Uno spettrometro di massa Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) con una sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI) è stato utilizzato in modalità di scansione completa e accoppiato con la modalità di monitoraggio ddMS2 per raccogliere grandi volumi di dati.I parametri MS sono stati impostati come segue: tensione di spruzzatura +3,8 kV/- 3,2 kV, temperatura capillare 320°C, gas di protezione 40 arb, gas ausiliario 10 arb, temperatura del riscaldatore della sonda 350°C, raggio di scansione 70–1050 m/h, risoluzione.70.000. I dati sono stati acquisiti utilizzando Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Per valutare la qualità dei dati, sono stati generati campioni di controllo qualità (QC) raggruppati rimuovendo aliquote da 10 μL del surnatante da ciascun campione.All'inizio della sequenza analitica sono state analizzate sei iniezioni di campioni di controllo qualità per valutare la stabilità del sistema UPLC-MS.I campioni di controllo qualità vengono quindi periodicamente introdotti nel lotto.Tutti gli 11 lotti di campioni di siero in questo studio sono stati analizzati mediante LC-MS.Aliquote di una miscela di pool di sieri provenienti da 100 donatori sani sono state utilizzate come materiale di riferimento nei rispettivi lotti per monitorare il processo di estrazione e regolare gli effetti da lotto a lotto.L'analisi metabolomica non mirata della coorte di scoperta, della coorte di validazione interna e della coorte di validazione esterna è stata eseguita presso il Centro di metabolomica dell'Università Sun Yat-sen.Il laboratorio esterno del Centro di analisi e test dell'Università di Tecnologia di Guangdong ha inoltre analizzato 40 campioni provenienti dal gruppo esterno per testare le prestazioni del modello di classificazione.
Dopo l'estrazione e la ricostituzione, la quantificazione assoluta dei metaboliti sierici è stata misurata utilizzando cromatografia liquida ad altissime prestazioni e spettrometria di massa tandem (triplo quadrupolo Agilent 6495) con una sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI) in modalità di monitoraggio di reazioni multiple (MRM).Per separare i metaboliti è stata utilizzata una colonna ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters).La fase mobile era costituita dal 90% (A) e dal 5% di acetonitrile (B) con 10 mmol/L di acetato di ammonio e 0,1% di soluzione di ammoniaca.Il programma del gradiente era il seguente: 0–1,5 minuti, 0% B;1,5–6,5 minuti, 0–15% B;6,5–8 minuti, 15% B;8–8,5 minuti, 15%–0% B;8,5–11,5 minuti, 0%B.La colonna è stata mantenuta a 40°C e il campione a 10°C nell'autocampionatore.La portata era di 0,3 ml/min e il volume di iniezione era di 1 μL.I parametri MS sono stati impostati come segue: tensione capillare ±3,5 kV, pressione del nebulizzatore 35 psi, flusso del gas guaina 12 l/min, temperatura del gas guaina 350°C, temperatura del gas di essiccazione 250°C e flusso del gas di essiccazione 14 l/min.Le conversioni MRM di triptofano, piruvato, lattato, ipoxantina e xantina erano 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 e 151,0–107.9 rispettivamente.I dati sono stati raccolti utilizzando Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Per i campioni di siero, triptofano, piruvato, lattato, ipoxantina e xantina sono stati quantificati utilizzando curve di calibrazione di soluzioni di miscele standard.Per i campioni cellulari, il contenuto di triptofano è stato normalizzato rispetto allo standard interno e alla massa proteica cellulare.
L'estrazione del picco (m/z e tempo di ritenzione (RT)) è stata eseguita utilizzando Compound Discovery 3.1 e TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Per eliminare potenziali differenze tra i lotti, ciascun picco caratteristico del campione in esame è stato diviso per il picco caratteristico del materiale di riferimento dello stesso lotto per ottenere l'abbondanza relativa.Le deviazioni standard relative degli standard interni prima e dopo la standardizzazione sono mostrate nella Tabella supplementare 6. Le differenze tra i due gruppi erano caratterizzate dal tasso di false scoperte (FDR <0,05, test dei ranghi con segno di Wilcoxon) e dal cambiamento di piega (>1,2 o <0,83).I dati MS grezzi delle caratteristiche estratte e i dati MS corretti nel siero di riferimento sono mostrati rispettivamente in Dati supplementari 1 e Dati supplementari 2.L'annotazione dei picchi è stata eseguita sulla base di quattro livelli definiti di identificazione, inclusi metaboliti identificati, composti presumibilmente annotati, classi di composti presumibilmente caratterizzati e composti sconosciuti 22 .Sulla base delle ricerche nel database in Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), i composti biologici con standard validati corrispondenti a MS/MS o annotazioni di corrispondenza esatta in mzCloud (punteggio > 85) o Chemspider sono stati infine selezionati come intermedi tra il metaboloma differenziale.Le annotazioni sui picchi per ciascuna caratteristica sono incluse nei Dati supplementari 3. MetaboAnalyst 5.0 è stato utilizzato per l'analisi univariata dell'abbondanza di metaboliti normalizzati in somma.MetaboAnalyst 5.0 ha valutato anche l'analisi dell'arricchimento del percorso KEGG sulla base di metaboliti significativamente diversi.L'analisi delle componenti principali (PCA) e l'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali (PLS-DA) sono state analizzate utilizzando il pacchetto software ropls (v.1.26.4) con normalizzazione dello stack e ridimensionamento automatico.Il modello di biomarcatore metabolita ottimale per prevedere la malignità del nodulo è stato generato utilizzando la regressione logistica binaria con il minor restringimento assoluto e l'operatore di selezione (LASSO, pacchetto R v.4.1-3).Le prestazioni del modello discriminante nei set di rilevamento e validazione sono state caratterizzate dalla stima dell'AUC basata sull'analisi ROC secondo il pacchetto pROC (v.1.18.0.).Il cut-off di probabilità ottimale è stato ottenuto in base all'indice Youden massimo del modello (sensibilità + specificità – 1).I campioni con valori inferiori o superiori alla soglia verranno previsti rispettivamente come noduli benigni e adenocarcinoma polmonare.
Le cellule A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) sono state coltivate in terreno F-12K contenente il 10% di FBS.Sequenze di RNA a forcina corta (shRNA) mirate a SLC7A5 e un controllo non mirato (NC) sono state inserite nel vettore lentivirale pLKO.1-puro.Le sequenze antisenso di shSLC7A5 sono le seguenti: Sh1 (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3'), Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').Gli anticorpi contro SLC7A5 (#5347) e tubulina (#2148) sono stati acquistati da Cell Signaling Technology.Gli anticorpi anti-SLC7A5 e tubulina sono stati utilizzati ad una diluizione di 1:1000 per l'analisi Western blot.
Il test dello stress glicolitico Seahorse XF misura i livelli di acidificazione extracellulare (ECAR).Nel test, glucosio, oligomicina A e 2-DG sono stati somministrati in sequenza per testare la capacità glicolitica cellulare misurata mediante ECAR.
Le cellule A549 trasfettate con controllo non mirato (NC) e shSLC7A5 (Sh1, Sh2) sono state placcate durante la notte in piastre da 10 cm di diametro.I metaboliti cellulari sono stati estratti con 1 ml di metanolo acquoso all'80% ghiacciato.Le cellule nella soluzione metanolo sono state raschiate via, raccolte in una nuova provetta e centrifugate a 15.000 × g per 15 minuti a 4°C.Raccogliere 800 µl di surnatante e asciugarli utilizzando un concentratore sotto vuoto ad alta velocità.I pellet di metaboliti essiccati sono stati quindi analizzati per i livelli di triptofano utilizzando LC-MS/MS come descritto sopra.I livelli cellulari di NAD(H) nelle cellule A549 (NC e shSLC7A5) sono stati misurati utilizzando un kit colorimetrico quantitativo NAD+/NADH (#K337, BioVision) secondo le istruzioni del produttore.I livelli proteici sono stati misurati per ciascun campione per normalizzare la quantità di metaboliti.
Non sono stati utilizzati metodi statistici per determinare preliminarmente la dimensione del campione.Precedenti studi di metabolomica mirati alla scoperta di biomarcatori15,18 sono stati considerati come parametri di riferimento per la determinazione delle dimensioni e, rispetto a questi rapporti, il nostro campione era adeguato.Nessun campione è stato escluso dalla coorte di studio.I campioni di siero sono stati assegnati in modo casuale a un gruppo di scoperta (306 casi, 74,6%) e a un gruppo di validazione interna (104 casi, 25,4%) per studi di metabolomica non mirati.Abbiamo anche selezionato casualmente 70 casi da ciascun gruppo dal set di scoperte per studi mirati di metabolomica.I ricercatori erano in cieco rispetto all'assegnazione dei gruppi durante la raccolta e l'analisi dei dati LC-MS.Le analisi statistiche dei dati metabolomici e degli esperimenti cellulari sono descritte nelle rispettive sezioni Risultati, Legende delle figure e Metodi.La quantificazione del triptofano cellulare, del NADT e dell'attività glicolitica è stata eseguita tre volte in modo indipendente con risultati identici.
Per ulteriori informazioni sul disegno dello studio, consultare il Natural Portfolio Report Abstract associato a questo articolo.
I dati MS grezzi delle caratteristiche estratte e i dati MS normalizzati del siero di riferimento sono mostrati rispettivamente in Dati supplementari 1 e Dati supplementari 2.Le annotazioni di picco per le caratteristiche differenziali sono presentate nei Dati supplementari 3. Il set di dati LUAD TCGA può essere scaricato da https://portal.gdc.cancer.gov/.I dati di input per tracciare il grafico sono forniti nei dati di origine.Per questo articolo vengono forniti i dati di origine.
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Orario di pubblicazione: 18 settembre 2023