Il sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) è una tecnica di editing genomico di terza generazione che ha rivoluzionato il mondo grazie alla sua elevata produttività. È stato utilizzato per trattare diverse malattie e infezioni biologiche. Anche vari batteri e altri procarioti (come gli archei) possiedono sistemi CRISPR/Cas9 per difendersi dai fagi. È stato dimostrato che le strategie basate su CRISPR/Cas9 possono inibire la crescita e la progressione del carcinoma mammario triplo negativo (TNBC) prendendo di mira geni di resistenza potenzialmente alterati, la trascrizione e la regolazione epigenetica. Questi interventi terapeutici potrebbero contribuire ad affrontare problemi complessi come la resistenza ai farmaci, osservata anche nel TNBC. Attualmente, vengono utilizzati diversi metodi per veicolare CRISPR/Cas9 alle cellule bersaglio, tra cui metodi fisici (microiniezione, elettroporazione e modalità idrodinamica), virali (virus adeno-associato e lentivirus) e non virali (liposomi e nanoparticelle lipidiche). Sebbene siano stati sviluppati diversi modelli per studiare le cause molecolari del TNBC, la mancanza di metodi sensibili e mirati per la somministrazione in vivo di strumenti di editing genomico ne limita l'applicazione clinica. In sintesi, questa revisione esamina in modo esaustivo i progressi, le sfide, i limiti e le prospettive del trattamento con CRISPR/Cas9 per il TNBC sulla base delle evidenze disponibili. Sottolineiamo inoltre come la combinazione di intelligenza artificiale e apprendimento automatico possa migliorare le strategie CRISPR/Cas9 nel trattamento del TNBC.
Il cancro è caratterizzato da una divisione cellulare incontrollata, dall'interruzione dei punti di controllo del ciclo cellulare e da mutazioni nei geni oncosoppressori (TSG) (Matthews et al., 2022). Tra i diversi tipi di cancro, il tumore al seno è il più comune nelle donne e presenta un alto tasso di mortalità a livello mondiale (Waks e Winer, 2019). Il tumore al seno è una malattia eterogenea con caratteristiche diverse, come le caratteristiche istologiche e biologiche, la presentazione e il comportamento clinico e la risposta al trattamento (Weigelt et al., 2010). La classificazione del tumore al seno fornisce informazioni precise per la diagnosi e la prognosi del tumore. L'uso di biomarcatori comuni e caratteristiche clinico-patologiche è stato il criterio principale per la classificazione del tumore al seno (Tsang e Tse, 2019). La prognosi e la risposta al trattamento del cancro al seno sono influenzate da numerosi fattori, tra cui la presenza del recettore degli estrogeni (ER), del recettore del progesterone (PR), del recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano (HER2/neu), il grado istologico, il tipo di tumore, le dimensioni e le metastasi linfonodali (Al-Tubaiti, 2020). Sono stati identificati cinque sottotipi molecolari intrinseci di cancro al seno, tra cui luminale A, luminale B, HER2-arricchito, basale e claudina-basso (Prat et al., 2015). Il TNBC è un sottotipo molecolare di cancro che non esprime tutti i recettori ER, PR e HER2 (Yin et al., 2020). Queste caratteristiche patologiche sono associate al TNBC, confermando la sua rapida progressione e la sua natura più aggressiva rispetto a qualsiasi altro tipo di cancro al seno (Feng et al., 2018). Inoltre, Peru et al (2000) hanno utilizzato la tecnologia microarray per riclassificare il cancro al seno e identificare cinque sottotipi intrinseci di cancro al seno (Cadenas, 2012). Il cancro al seno basale è un sottotipo di cancro al seno che presenta un fenotipo triplo negativo ed è associato a una rapida progressione. Va notato che tutti i tumori al seno basali vengono comunemente diagnosticati erroneamente come TNBC, ma solo il 77% è TNBC; al contrario, il 71-91% dei TNBC sono basali, il che indica che questi due tipi di cancro al seno si sovrappongono e rappresentano classificazioni diverse (Wang D.-Y. et al., 2019). Ciò crea la necessità di caratterizzare l'eterogeneità del TNBC per chiarire la prognosi e identificare le potenziali risposte ai trattamenti attuali e futuri. Inoltre, il TNBC rappresenta il 15-20% di tutti i casi di cancro al seno ed è più comune nelle donne di età inferiore ai 50 anni. Mutazioni BRCA1 o BRCA2 sono state riscontrate in circa il 20% dei casi di TNBC (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017, 2020). Studi hanno inoltre dimostrato che il TNBC presenta un microambiente immunitario distinto, caratterizzato da alti livelli di fattori di crescita endoteliale vascolare, macrofagi associati al tumore (TAM), linfociti infiltranti il tumore (TIL) e altre molecole coinvolte nella crescita e nella migrazione tumorale. Pertanto, la comprensione del microambiente del TNBC è fondamentale per la sua prognosi e il suo trattamento (Fan e He, 2022).
Per valutare la prognosi del TNBC e garantire un trattamento efficace, è fondamentale una diagnosi accurata, basata principalmente sull'immunoistochimica (IHC) per rilevare ER, PR e HER2, e sulla mammografia per individuare le neoplasie mammarie. Tuttavia, la mammografia non è in grado di visualizzare adeguatamente le caratteristiche intratumorali come necrosi e fibrosi (Deepak Singh et al., 2021). Poiché una prognosi e una diagnosi errate impediscono ai medici di prescrivere i farmaci più appropriati (Chaudhary, 2020), vengono utilizzate diverse strategie per migliorare la cura delle pazienti affette da TNBC. Attualmente, due farmaci, la doxorubicina e la ciclofosfamide, sono utilizzati nelle pazienti con TNBC e hanno mostrato buoni risultati. Inoltre, vengono utilizzati anche altri farmaci a base di platino, come il carboplatino e il cisplatino (Sikov et al., 2015). Inoltre, gli inibitori di PARP come Olaparib, Velaparib e PF-01367338 sono stati utilizzati come potenziali farmaci chemioterapici per il trattamento del TNBC (Ishino et al., 2018). Poiché è stato riportato che le vie di segnalazione Wnt/β-catenina, NOTCH e Hedgehog sono coinvolte nell'insorgenza e nella progressione del TNBC, indirizzare i farmaci verso queste vie potrebbe essere una strategia importante (Aysola et al., 2013). Sebbene la chirurgia, la radioterapia e la chemioterapia rimangano oggi i pilastri del trattamento del TNBC, sono stati compiuti progressi significativi nello sviluppo di nuove terapie, tra cui la terapia mirata, l'immunoterapia, vari strumenti di editing genetico correlati a CRISPR come Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, prime editing e la terapia genica mirata CRISPR/Cas9. In questa sede ci concentreremo sui vari strumenti di editing genetico correlati a CRISPR utilizzati nel trattamento del TNBC. Tra questi, CRISPR/Cas9 ha ricevuto un'attenzione molto ampia.
Cas9n, nota anche come Cas9 nickasi, è una variante geneticamente modificata della proteina Cas9 derivata dal sistema di editing genomico CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). Nella sua forma originale, la proteina Cas9 contiene due domini nucleasici: RuvC e HNH, la cui funzione principale è la scissione di entrambi i filamenti di DNA. Tuttavia, in Cas9n, uno dei domini nucleasici, HNH, è geneticamente mutato e diventa inattivo. Pertanto, il dominio HNH di Cas9n rimane non funzionale. Solo il dominio RuvC rimane attivo, consentendo a Cas9n di tagliare o creare rotture su singoli filamenti di DNA (Trevino e Zhang, 2014). Rispetto a Cas9, Cas9n può ridurre efficacemente gli effetti fuori bersaglio e migliorare con precisione i meccanismi di riparazione cellulare. Cas9n può essere utilizzata per risolvere diversi problemi, come la creazione di rotture in posizioni specifiche nel DNA a doppio filamento. A tale scopo, due molecole di Cas9n sono state combinate e utilizzate insieme (Yee, 2016). La chinasi 3 a linea mista (MLK3) è una proteina chinasi attivata da mitogeni che funge da regolatore chiave durante la metastasi del TNBC (Cronan et al., 2012).
MLK3 può attivare molteplici vie di segnalazione che portano alla metastasi del TNBC. Ad esempio, la via della chinasi c-Jun N-terminale (JNK) regola la motilità cellulare e la degradazione della matrice extracellulare, e MLK3 attiva la via JNK, aumentando così la motilità cellulare e conferendo proprietà invasive (Rattanasinchai e Gallo, 2016). MLK3 regola anche la transizione epitelio-mesenchimale (EMT). Per fare ciò, attiva fattori di trascrizione a valle come Snail, Slug e Twist. Questi fattori inibiscono l'espressione dei marcatori epiteliali e promuovono l'espressione dei marcatori mesenchimali, portando all'acquisizione di un fenotipo metastatico (Casalino et al., 2023). È stato osservato che MLK3 svolge un ruolo nel rimodellamento della matrice extracellulare (ECM) e nell'attivazione di proteasi come le metalloproteinasi della matrice (MMP) che degradano l'ECM. Ciò facilita l'invasione delle cellule tumorali e la diffusione in siti distanti (Katari et al., 2019). Pertanto, studi precedenti hanno dimostrato che MLK3 svolge un ruolo critico nel TNBC. Rattanasinchai e Gallo hanno utilizzato modelli di TNBC per studiare il ruolo di MLK3 e hanno scoperto che promuove lo sviluppo del cancro attraverso specifici percorsi di segnalazione. Hanno utilizzato CRISPR/Cas9n per modificare MLK3 e hanno osservato una significativa riduzione delle metastasi del TNBC (Rattanasinchai e Gallo, 2016).
dCas9, spesso chiamata Cas9 inattiva, è una forma derivata modificata della proteina Cas9. A differenza della Cas9 attiva, dCas9 è priva di attività endonucleasica, il che le impedisce di indurre rotture a doppio filamento del DNA. Pertanto, dCas9 può essere utilizzata per colpire con precisione regioni specifiche del genoma senza alterare la sequenza del DNA (Wang et al., 2016). In dCas9, due proteine endonucleasiche, RuvC e HNH, vengono inattivate sopprimendo importanti residui amminoacidici (Richter et al., 2016). Nonostante la sua mancanza di attività di clivaggio del DNA, dCas9 svolge una serie di ruoli importanti nella ricerca genetica e nelle biotecnologie. Ad esempio, consente la visualizzazione di regioni specifiche del genoma, facilita la regolazione trascrizionale e promuove modificazioni epigenetiche (Brocken et al., 2018).
Il fattore di trascrizione ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) svolge un ruolo specifico e critico nella mediazione della transizione epitelio-mesenchimale (EMT), un processo cellulare che si verifica durante lo sviluppo embrionale, la riparazione dei tessuti e la progressione del cancro. Esso comporta la trasformazione delle cellule epiteliali in cellule mesenchimali, con conseguenti cambiamenti nella morfologia cellulare, nella motilità, nell'invasività, ecc. (Wu et al., 2020). ZEB1 inibisce diversi marcatori epiteliali, come la E-caderina e l'occludina, responsabili del mantenimento dell'adesione cellula-cellula e della polarità delle cellule epiteliali nel TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Inoltre, ZEB1 attiva alcuni marcatori come N-caderina, vimentina e fibronectina (Konradi et al., 2014) e regola anche i geni coinvolti nel rimodellamento del citoscheletro come le GTPasi Rho e le metalloproteinasi della matrice (MMP) (Huang et al., 2014). 2022), inoltre, influenza anche diverse vie di segnalazione come il fattore di crescita trasformante-β (TGF-β), la segnalazione Wnt, ecc., promuovendo così l'invasione tumorale e le metastasi nel TNBC (Chen et al., 2016). Numerosi studi e prove scientifiche indicano che ZEB1 ha un grande potenziale come agente prezioso per la rilevazione e l'intervento terapeutico del TNBC. In un recente studio, Waryah et al. hanno utilizzato un modello di TNBC e hanno ottenuto la completa soppressione di ZEB1 tramite dCas9. Pertanto, hanno osservato un'altissima specificità e un'inibizione quasi completa di ZEB1 in condizioni in vivo (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 è uno strumento di editing genetico chiamato CRISPR/Cpf1. Deriva dal sistema CRISPR/Cas, dove il termine Cas12 si riferisce alla proteina 12 associata a CRISPR (Bharathkumar et al., 2022), che è completamente simile a Cas9. L'unica differenza è che contiene la proteina Cas12. Rispetto a Cas9, Cas12 ha alcune funzioni uniche, come la generazione di estremità adesive durante il processo di editing genetico, mentre Cas9 genera estremità piatte (Wang et al., 2021). Questa proprietà di Cas12 contribuisce alla sua specifica tecnologia di manipolazione del DNA. Essendo una proteina in grado di riconoscere e tagliare con precisione il DNA bersaglio, possiede una straordinaria versatilità, che la rende uno strumento efficace per una varietà di applicazioni, tra cui l'editing genetico (Pickar-Oliver e Gersbach, 2019).
Analogamente ad altre varianti di CRISPR, anche CRISPR/Cas12 è in grado di inattivare o attivare geni nel TNBC, prendendo di mira geni che svolgono un ruolo importante nella sua patogenesi o nella risposta al trattamento (Yang e Zhang, 2023). Per realizzare questo processo, è stato sviluppato un RNA guida (gRNA) che indirizza Cas12 verso il gene bersaglio. Una volta che Cas12 si lega al suo bersaglio, introduce rotture a doppio filamento nel DNA e attiva i meccanismi di riparazione del DNA. Durante il processo di riparazione, possono essere incorporati nucleotidi errati, portando a mutazioni geniche e perdita di funzione (Zhang et al., 2021a). Inoltre, è stata utilizzata anche una versione migliorata dell'enzima Cas12 (chiamata dCas12) per attivare i geni. Combinandola con un attivatore della trascrizione, è possibile indurre determinati geni, attivandoli. Questa tecnologia ha un grande potenziale nel promuovere l'attivazione dei geni oncosoppressori (Sultan et al., 2022).
Il prime editing è una tecnologia di editing genomico di recente sviluppo ed estremamente avanzata. È in grado di modificare il DNA di un organismo con grande precisione (Chen e Liu, 2023). Il prime editing si realizza attraverso l'integrazione di due componenti principali: un enzima CRISPR/Cas9 modificato e la trascrittasi inversa. Il ruolo dell'enzima CRISPR/Cas9 è quello di colpire selettivamente siti precisi nel genoma, mentre la trascrittasi inversa contribuisce a modificare accuratamente il DNA nella posizione bersaglio (Hassan et al., 2021). Nel meccanismo del primer editing, il primo passaggio prevede la creazione di un RNA guida per il primer editing (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Esso contiene la sequenza bersaglio e il modello di RNA corrispondente al sito di editing desiderato nel DNA bersaglio. Il pegRNA viene quindi introdotto nelle cellule bersaglio insieme a una nucleasi per il primer editing (PE2). PE2 è una proteina di fusione composta da un enzima Cas9, una trascrittasi inversa e un adattatore per l'editing del primer (Martín-Alonso et al., 2021). All'interno della cellula, i complessi pegRNA e PE2 cercano il DNA specifico che desiderano modificare. L'enzima Cas9 taglia il DNA e crea un modello costituito da singoli filamenti (Choi et al., 2022). La trascrittasi inversa utilizza questo modello per preparare il DNA per l'editing. Oltre alla copia del DNA, sono incluse anche le istruzioni per la modifica del modello di RNA. Infine, il filamento di DNA appena creato viene utilizzato come modello per riparare la rottura nel DNA, con conseguente sequenza di DNA alterata contenente la modifica desiderata (Ochoa-Sanchez et al., 2021). I meccanismi di editing del primer possono portare a mutazioni diffuse nei geni. Possono colpire mutazioni puntiformi, inserzioni, delezioni e persino sostituzioni geniche (Anzalone et al., 2019; Chen e Liu, 2023). Il prime editing offre diversi vantaggi rispetto alle precedenti tecnologie di editing genomico. Tra questi, una maggiore precisione, una riduzione degli effetti fuori bersaglio e la capacità di modificare il DNA senza fare affidamento su rotture a doppio filamento del DNA (Anzalone et al., 2020).
La tecnologia CRISPR/Cas9 è stata originariamente sviluppata per proteggere i batteri dal trasferimento di plasmidi e dalle infezioni da fagi, ed è stata successivamente riutilizzata come efficace strumento di targeting del DNA basato sull'RNA per la modifica del genoma (Jiang e Doudna, 2017). Inoltre, è stato riportato che il sistema CRISPR/Cas9 è presente nel 50% e nell'87% dei genomi batterici e archeali, rispettivamente (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 è un potenziale strumento per la delezione, l'inserimento e la correzione di qualsiasi sequenza genetica anomala utilizzando modalità in vivo e in vitro (Sabit et al., 2021). Inoltre, è stato dimostrato che CRISPR/Cas9 fa parte del sistema immunitario adattativo grazie alla sua specificità per i geni bersaglio di interesse (Chen e Zhang, 2018).
Il sistema CRISPR/Cas9 è costituito da Cas9 e da un singolo RNA guida (sgRNA). Cas9 è un'endonucleasi composta da molteplici componenti proteiche. Inoltre, Cas9 possiede proprietà strutturali e conformazionali uniche (Pacesa et al., 2022) in quanto è costituito da due lobi: il lobo di riconoscimento (REC) e il lobo nucleasico (NUC). Il lobo REC è ulteriormente suddiviso in tre regioni: REC1, REC2 e le eliche di collegamento (Cromwell et al., 2018). Il lobo NUC è costituito da tre lobi, ovvero RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH e il dominio di interazione con il motivo adiacente al protospacer (PAM) (Fig. 1) (Song et al., 2016). L'sgRNA è costituito da due componenti, tra cui l'RNA CRISPR (crRNA) e il piccolo RNA transcodificante (RNA tracciante) (Figura 1). L'sgRNA collega la proteina Cas9 alle connessine per formare un complesso attivo, noto anche come complesso effettore (Richter et al., 2012). Il crRNA è una sequenza di 18-20 nucleotidi che svolge un ruolo cruciale nel riconoscimento delle sequenze di DNA bersaglio. Inoltre, il crRNA si appaia con il DNA bersaglio e il tracrRNA funge da impalcatura per la nucleasi Cas9, permettendole di legarsi al DNA bersaglio (Manghwar et al., 2019). D'altra parte, la sequenza PAM, composta da 3 nucleotidi, conferma, specifica e media il legame del complesso effettore al DNA. Le subunità RuvC e HNH del complesso proteico Cas9 possiedono attività catalitica (Richter et al., 2012; Asmamaw e Zawdie, 2021). Il dominio nucleasico HNH della subunità Cas9 taglia il filamento di DNA associato al crRNA. Il dominio nucleasico RuvC taglia altri filamenti di DNA e genera rotture a doppio filamento (DSB), dopo le quali vengono attivati due diversi meccanismi di riparazione delle rotture del DNA (Jiang e Doudna, 2017) (Figura 1).
Figura 1. Panoramica di CRISPR/Cas9 (A). Componenti del sistema CRISPR/Cas9: (i). L'endonucleasi Cas9 è responsabile del taglio della sequenza di DNA bersaglio, (ii) un singolo RNA guida (sg) risultante dalla fusione di chimere crRNA e tra-crRNA. (due). Cas9 include diversi componenti come Rec I, Rec II, lobo NUC (HNH e Ruv C sono sottocomponenti) e dominio di interazione PAM (C) con funzioni corrispondenti. Il complesso proteico CRISPR/Cas9 taglia le sequenze di DNA in forme non complementari e complementari (D). CRISPR/Cas9 modifica il genoma in tre fasi: riconoscimento, taglio e riparazione. L'sgRNA progettato guida Cas9 e riconosce la sequenza desiderata attraverso il componente complementare crRNA. Cas9 riconosce la sequenza PAM in 5′-NGG-3′ e fonde il DNA, formando un ibrido DNA-RNA e attivando il taglio. Il dominio HNH di Cas9 taglia il filamento complementare, mentre il dominio RuvC taglia il filamento non complementare. Il sistema CRISPR/Cas9 ripara il DNA a doppio filamento rompendolo in due modi: tramite la giunzione delle estremità non omologhe (NHEJ) e la riparazione diretta dall'omologia (HDR). La NHEJ ripara il DNA a doppio filamento in assenza di DNA omologo estraneo attraverso un processo enzimatico, un meccanismo soggetto a errori che può inserire o rimuovere sequenze di DNA casuali. L'HDR è molto specifica e richiede stampi di DNA omologo.
I meccanismi di riparazione mediati da CRISPR/Cas9 includono la giunzione delle estremità non omologhe (NHEJ) e la riparazione diretta dall'omologia (HDR). La NHEJ è un meccanismo soggetto a errori perché comporta inserzioni o delezioni e non richiede alcun modello specifico durante il processo di riparazione. Utilizza nucleotidi casuali per generare proteine standard (Abbasi et al., 2021). Questo sistema di riparazione è costituito da quattro complessi: il complesso KU, il complesso proteico di complementazione incrociata di tipo 4 (XRCC-4), l'enzima di elaborazione delle estremità del DNA e la proteina chinasi DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). La proteina del complesso KU ha due subunità, Ku 70 e Ku 80, e svolge un ruolo importante nel meccanismo NHEJ, poiché il meccanismo di riparazione viene avviato dal legame di due subunità (Ku 70 e Ku 80) alle estremità piatte o quasi piatte del DNA bersaglio (Abbasi et al., 2021), fungendo da impalcatura per reclutare altri fattori correlati all'NHEJ nel sito della lesione (Yang et al., 2020). XRCC-4 e la DNA ligasi sono composte rispettivamente da 334 e 911 amminoacidi e il complesso XRCC4-DNA ligasi IV stimola la ligazione delle estremità del DNA (Chatterjee et al., 2015). L'enzima di elaborazione delle estremità del DNA, noto anche come polinucleotide chinasi 3'-fosfato, è un enzima che elabora le estremità del DNA. Può rimuovere il gruppo 3'P nel DNA e fosforilare il gruppo 5'OH durante la riparazione delle rotture a doppio filamento (DSB). Coinvolge anche la riparazione delle rotture a singolo filamento (SSB) utilizzando il percorso di riparazione SSB (Chatterjee et al., 2015). La proteina chinasi DNA-PKcs è una proteina chinasi dipendente dal DNA che consiste in una subunità catalitica delle PIKK (chinasi correlate alla fosfatidilinositolo 3-chinasi) e della famiglia dell'atassia telangiectasia mutata (ATM), nonché delle ATR correlate ad ATM e Rad3. rotture a singolo filamento (DSB) e rotture a singolo filamento (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
L'HDR è un meccanismo di riparazione più accurato e adatto perché le informazioni vengono copiate utilizzando la forma intatta del duplex di DNA omologo, sebbene richieda la presenza di cromatidi fratelli. Questo avviene durante la fase S/G2 del ciclo cellulare dei mammiferi. L'HDR si verifica principalmente nelle specie di lievito, ma l'NHEJ è fondamentale nei mammiferi (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Il meccanismo di riparazione completo è mostrato nella Figura 1.
Poiché il TNBC è causato da anomalie genetiche ed epigenetiche, la correzione delle anomalie genomiche/epigenomiche maligne mediante CRISPR/Cas9 potrebbe rappresentare un approccio terapeutico valido (Chen et al., 2019). Inoltre, alcuni fattori di trascrizione coinvolti nella regolazione trascrizionale specifica delle cellule possono presentare caratteristiche uniche delle cellule tumorali, suggerendo che la regolazione trascrizionale potrebbe essere un approccio eccellente per il trattamento del cancro (Drost et al., 2017). Sfruttare queste caratteristiche molecolari dei tumori, come i difetti genetici, epigenetici e trascrizionali, per lo sviluppo di farmaci può migliorare gli esiti clinici e ridurre i costi di screening. CRISPR è un potenziale strumento di editing genetico in grado non solo di rilevare e identificare i bersagli genomici responsabili del cancro, ma anche di essere utilizzato per modificare, sopprimere e modificare epigeneticamente gli oncogeni nelle cellule umane (Tabella 1) (Ahmed et al., 2021). Sono stati condotti diversi screening CRISPR per individuare geni associati a geni oncosoppressori, oncogeni e resistenza ai farmaci. L'utilizzo di CRISPR/Cas9 per modificare vari oncogeni del TNBC è illustrato nella Figura 2.
Figura 2. Modifica genetica di vari oncogeni del TNBC mediante CRISPR/Cas9 che ha portato a una riduzione della crescita tumorale e delle metastasi. Questi oncogeni includono CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 e CXCR7, Crypto1, ROR1 e ST8SIA, che sono coinvolti nell'insorgenza e nella metastasi del TNBC.
La migrazione, l'invasione e la transizione epitelio-mesenchimale (EMT) delle cellule tumorali sono associate a ITGA9. Studi precedenti hanno dimostrato che ITGA9 è un attore chiave nella via di segnalazione Notch e svolge un ruolo interessante nella metastasi del rabdomiosarcoma (Molist et al., 2020). Inoltre, è stato riscontrato che ITGA9 è strettamente associato alla prognosi dei pazienti in diversi tipi di tumore, incluso il cancro al seno (Wang Z. et al., 2019). L'analisi bioinformatica di ITGA9 ha inoltre mostrato che la sua espressione nel TNBC era significativamente più elevata rispetto ad altri sottotipi di cancro al seno. Livelli elevati di ITGA9 sono associati alla metastasi e alla recidiva del tumore nei pazienti con TNBC. L'inattivazione di ITGA9 tramite CRISPR/Cas9 ha determinato proprietà simili a quelle delle cellule staminali tumorali (CSC), angiogenesi tumorale, crescita tumorale e riduzione delle metastasi, promuovendo la degradazione della β-catenina nel TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Crypto-1 è un membro della famiglia TGF-β ed è fondamentale per l'embriogenesi precoce, il mantenimento delle cellule staminali e la metastasi del cancro (Ishii et al., 2021). Conosciuto anche come Tdgf-1, è una proteina di segnalazione oncogenica ancorata al GPI coinvolta nella regolazione della formazione della stria primitiva, del mesoderma e dell'endoderma, nonché nella definizione dell'asimmetria sinistra/destra nello sviluppo degli organi del corpo durante l'embriogenesi (Zhang et al., 2021b). Inoltre, è stato dimostrato che Crypto-1 è coinvolto nella transizione epitelio-mesenchimale (EMT) come marcatore delle cellule staminali (Zhang et al., 2021b). L'EMT è fondamentale non solo per vari processi come lo sviluppo embrionale, la fibrosi e la guarigione delle ferite, ma anche per l'invasione e la metastasi del cancro. Inoltre, è stato dimostrato che Crypto-1 interagisce con quattro recettori Notch e ne potenzia la maturazione post-traduzionale (Brandstadter e Maillard, 2019). È noto che la via di segnalazione Notch è coinvolta nel mantenimento delle cellule del carcinoma mammario umano. Studi hanno dimostrato che l'eliminazione di Crypto-1 tramite CRISPR/Cas9 sopprime la crescita e la metastasi del cancro. Pertanto, Crypto-1 potrebbe diventare un importante bersaglio terapeutico per il carcinoma mammario triplo negativo (TNBC) (Castro et al., 2015).
La proteina XCL12 e il suo recettore delle chemochine CXC (CXCR4 e CXCR7) svolgono vari ruoli nella proliferazione, crescita, migrazione e invasione delle cellule tumorali (Wu et al., 2015). Questi chemiorecettori sono stati associati allo sviluppo del TNBC attraverso molteplici vie di segnalazione sia in modelli in vivo che in vitro (Wu et al., 2015). Inoltre, l'attivazione di CXCR4 e CXCR7 è associata a una maggiore suscettibilità alle metastasi e a una prognosi sfavorevole nel TNBC (Karn et al., 2022). Pertanto, l'eliminazione di CXCR4 e CXCR7 potrebbe diventare un bersaglio farmacologico efficace per il trattamento del cancro al seno, incluso il TNBC. Studio di Yang et al. Yang et al (2019) hanno utilizzato CRISPR/Cas9 per inattivare contemporaneamente i geni CXCR4 e CXCR7 e hanno scoperto che la proliferazione, la crescita, la migrazione e l'invasione del TNBC erano significativamente inibite (Yang et al., 2019).
Livelli aumentati di miR-3662, un oncogene del TNBC, sono stati osservati nei tessuti del carcinoma mammario (Yi et al., 2022). È stato dimostrato che la soppressione di miR-3662 inibisce la crescita tumorale e le metastasi del carcinoma mammario sia in vivo che in vitro (Agarwal e Gupta, 2021). HBP-1 è un potente inibitore della via di segnalazione Wnt/β-catenina ed è probabilmente responsabile della crescita delle cellule TNBC mediata da miR-3662. Recentemente, Yi et al. hanno scoperto che l'asse miR-3662-HBP1 regola la via di segnalazione Wnt/β-catenina nelle cellule TNBC (Yi et al., 2022). Data la sua espressione specifica nel tumore, miR-3662 potrebbe rappresentare un potenziale bersaglio terapeutico per il TNBC. Pertanto, la soppressione di miR-3662 mediata da CRISPR/Cas9 potrebbe rappresentare un approccio eccellente per lo sviluppo di nuovi farmaci per il trattamento del tumore al seno triplo negativo (TNBC).
UBR5 è una nucleofosfoproteina di 300 kDa che è stata identificata come un regolatore chiave della tumorigenesi, della metastasi e della risposta immunitaria in vari tumori (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). È stato riportato che UBR5 è fortemente sovraregolata nei campioni di TNBC e stimola la funzione di ERα inducendo la proliferazione attraverso la sua attività di ubiquitina ligasi (Bolt et al., 2015). Studi di sequenziamento dell'intero esoma su campioni primari di TNBC hanno anche mostrato un'espressione aumentata di UBR5, suggerendo il suo ruolo nello sviluppo del TNBC. Inoltre, la delezione di UBR5 guidata da CRISPR/Cas9 ha mostrato una significativa inibizione della metastasi e della crescita del TNBC in modelli murini sperimentali. Inoltre, l'inclusione di UBR5 in un modello murino wild-type ha ripristinato la sua piena funzionalità, mentre questo effetto non è stato osservato nei ceppi mutanti inattivati (Liao et al., 2017). La mancanza di UBR5 è associata ad un aumento dell'apoptosi, della necrosi e all'inibizione della crescita tumorale nel TNBC a causa di una scarsa angiogenesi. A causa della perdita di UBR5, la diffusione del tumore agli organi distanti è ridotta e UBR5 induce una transizione epitelio-mesenchimale (EMT) anomala principalmente riducendo l'espressione della E-caderina (Zhang e Weinberg, 2018). Recentemente, è stato dimostrato che UBR5 è un fattore molto importante nella trascrizione di PDL1 indotta da IFN-γ nel TNBC a causa della sua mancanza di attività di ubiquitinazione E3. L'analisi del trascrittoma dell'RNA ha rivelato che UBR5 può avere effetti sistemici sui geni associati alla via di segnalazione dell'IFN-γ e promuovere la transattivazione di PDL1 aumentando i livelli di attivazione della proteina chinasi RNA (PKR) e dei suoi trasduttori e attivatori di segnale, transcription 1 (STAT1) e interferon regulatory factor 1 (IRF1). Tuttavia, l'ablazione combinata di UBR5 e dell'espressione di PD-L1 mediata da CRISPR/Cas9 ha un effetto terapeutico sinergico rispetto al blocco di ciascuna proteina singolarmente, con effetti profondi sul microambiente tumorale (Wu et al., 2022). Pertanto, CRISPR/Cas9 potrebbe essere uno strumento importante per inibire la funzione di UBR5, sopprimendo così la metastasi e la crescita del tumore al seno triplo negativo (TNBC).
ROR1 è una proteina transmembrana di tipo I espressa durante lo sviluppo tumorale ed embrionale ed è stata identificata come proteina oncofetale (Nicholas Borcherding, 2014). Il comportamento invasivo di vari tumori umani è associato alla sovraregolazione di ROR1. Risultati promettenti sono stati ottenuti da studi in vivo e in vitro che coinvolgono composti terapeutici mirati a ROR1 (Chien et al., 2016). Livelli elevati di mRNA di ROR1 nelle biopsie del tessuto mammario sono stati anche associati a tumori mammari basali (BL) aggressivi e alla loro migrazione in altre parti del corpo. Inoltre, la sovraespressione di ROR1 è stata identificata come un marcatore prognostico per lo sviluppo del TNBC (Chien et al., 2016). Tuttavia, il silenziamento di ROR1 mediante CRISPR/Cas9 per sopprimere la crescita e le metastasi del TNBC potrebbe rappresentare una strategia efficace.
Il processo di sialilazione prevede l'aggiunta di acido sialico ai glicoconiugati, catalizzata dalle sialiltransferasi (ST). La ST8SIA1 appartiene alla famiglia delle ST e svolge un ruolo importante nella patogenesi di diverse malattie, come la leucemia linfatica e il cancro del colon-retto (Chang et al., 2018). L'analisi della sequenza di RNA mostra che la ST8SIA1 è altamente espressa nel tessuto mammario di pazienti con TNBC ed è positivamente correlata alle mutazioni nel gene oncosoppressore p53, che possono contribuire alla patogenesi del TNBC (Battula et al., 2017). Inoltre, la ST8SIA1 è coinvolta nella metastasi e nella recidiva del TNBC, suggerendo che svolga un ruolo importante nell'insorgenza e nello sviluppo di questa patologia. In un modello in vitro di TNBC, è stato dimostrato che la riduzione dell'espressione di ST8SIA1 tramite CRISPR/Cas9 blocca la crescita e la metastasi (Battula et al., 2017). Ciò suggerisce che CRISPR/Cas9 potrebbe essere uno strumento importante per inibire la funzione dell'oncogene ST8SIA1 nel trattamento del tumore al seno triplo negativo (TNBC).
NAT1 è un enzima metabolico che catalizza la formazione di composti xenobiotici di fase II ed è espresso in quasi tutti i tessuti umani. NAT1 può utilizzare il cofattore folato per indirizzare l'acetil-CoA anche in assenza del substrato amminico aromatico (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Studi hanno dimostrato che NAT1 regola la funzione della metalloproteinasi di matrice 9 (MMP9) in modelli di cellule di cancro al seno e protegge dalle specie reattive dell'ossigeno (ROS) durante la carenza di glucosio (Wang et al., 2018). È stato dimostrato che la delezione di NAT1 inibisce il complesso della piruvato deidrogenasi, portando a disfunzione mitocondriale (Wang L. et al., 2019). Inoltre, diverse altre segnalazioni hanno dimostrato che l'inibizione di NAT1 mediante piccole molecole e silenziamento con siRNA può ridurre l'invasività e la proliferazione delle cellule di cancro al seno (Stepp et al., 2018). Recentemente, la tecnologia CRISPR/Cas9 è stata utilizzata per sopprimere NAT1 nella linea cellulare di carcinoma mammario MDA-MB-231, influenzando il metabolismo cellulare a seconda del suo livello di espressione. Questo studio ha anche dimostrato che NAT-1 è fondamentale per la progressione e la metastasi del carcinoma mammario triplo negativo (TNBC) (Carlisle et al., 2020).
La trascrizione coordinata degli oncogeni è regolata da super-enhancer, fattori di trascrizione e cofattori (Hnisz et al., 2015). Inoltre, un gruppo di chinasi ciclina-dipendenti (CDK), come CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 e CDK13, sono necessarie per la regolazione trascrizionale. Tra queste, CDK7 è coinvolta nella fosforilazione della RNA polimerasi II, che è molto importante per l'inizio e l'espansione della trascrizione degli oncogeni nella patogenesi del TNBC. In uno studio fondamentale, la delezione di CDK7 tramite CRISPR/Cas9 ha inibito il TNBC, indicando che la patogenesi del TNBC è dipendente da CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Studi hanno dimostrato che mutazioni in MYC e RBP (proteina legante l'RNA) possono portare all'apoptosi, mentre mutazioni di singoli geni in MYC o RBP non influenzano la crescita delle cellule tumorali (Einstein et al., 2021). Più di 1000 RBP nel genoma umano sono state analizzate utilizzando una libreria basata su CRISPR/Cas9. Tra queste, 57 RBP sono risultate cruciali per la crescita delle cellule tumorali con livelli di MYC molto elevati (Wheeler et al., 2020). Inoltre, YTHDF2 è importante per il mantenimento della crescita delle cellule TNBC e riduce la quantità di trascritti metilati durante la trascrizione e la traduzione ad alto livello nelle cellule tumorali con maggiore espressione di MYC. Inoltre, YTHDF2 non è essenziale per le cellule tumorali, che sono meno dipendenti da livelli elevati di MYC per prolungare la sopravvivenza delle pazienti con TNBC (Einstein et al., 2021), suggerendo che potrebbe essere un potenziale bersaglio terapeutico per farmaci in grado di contrastare il TNBC.
Le proteine a dito di zinco (ZNF) costituiscono circa l'1% del genoma umano totale. Studi hanno dimostrato che le ZNF possono regolare la proliferazione cellulare in vari tipi di cancro, come il cancro al fegato, al seno e al colon-retto (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Le librerie generate tramite knockout CRISPR sono state utilizzate per analizzare diversi geni oncosoppressori (TSG) nelle cellule del cancro al seno (Shalem et al., 2014). Da allora, uno studio trascrittomico su cellule di cancro al seno con delezione di ZNF319 tramite CRISPR/Cas9 ha dimostrato che ZNF319 è un gene oncosoppressore che riduce la proliferazione del cancro al seno ed è quindi coinvolto in vari potenziali meccanismi di segnalazione e altre funzioni biologiche (Wang L. et al., 2022).
La ferroptosi è un tipo di morte cellulare programmata che dipende dalla presenza di ferro. È noto che lo sviluppo della ferroptosi è influenzato dalla presenza di perossidi lipidici. Inoltre, è stato riportato che la PKCβII è coinvolta nella perossidazione lipidica precoce e che un aumento della perossidazione lipidica è associato alla ferroptosi. Lo screening di una libreria di inibitori chinasi mediati da CRISPR/Cas9 ha rivelato che la PKCβII è coinvolta nel processo di perossidazione lipidica, che è fondamentale per la ferroptosi nelle cellule MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). Pertanto, ciò suggerisce che l'eliminazione della PKCβII tramite CRISPR/Cas9 potrebbe essere un potenziale bersaglio genico oncosoppressore per il trattamento delle malattie correlate alla ferroptosi (Zhang et al., 2022).
Si ritiene che la resistenza ai farmaci sia responsabile di circa il 90% dei decessi nei pazienti oncologici e rappresenta una delle principali sfide nel trattamento del cancro (Bukowski et al., 2020). I risultati indicano che un numero sufficiente di geni correlati all'efflusso dei farmaci, alla riparazione del DNA, all'apoptosi e a diverse vie di segnalazione cellulare sono associati alla resistenza ai farmaci (Haider et al., 2020). Tra questi, diversi geni sono stati presi di mira dagli strumenti CRISPR/Cas9 e hanno mostrato risultati promettenti nella riduzione della resistenza ai farmaci e nell'aumento dell'efficacia dei trattamenti antitumorali (Vaghari-Tabari et al., 2022). Inoltre, le librerie di screening di knockout genico CRISPR/Cas9 ad alto rendimento sono state implicate nella modifica della funzione di potenziali geni bersaglio della resistenza ai farmaci (Shalem et al., 2015). Per identificare i geni di resistenza al paclitaxel, è stato utilizzato il sequenziamento dell'RNA accoppiato allo screening della libreria sgRNA a livello genomico per identificare otto geni candidati, tra cui l'istone deacetilasi 9 (HDAC9), che sono associati alla resistenza ai farmaci nei pazienti con TNBC ricorrente (B et al., 2020). In un altro studio, è stata osservata una maggiore espressione della proteina chinasi diserina/treonina e tirosina (DSTYK) durante la sopravvivenza dei pazienti con TNBC trattati con farmaci antitumorali. Inoltre, il silenziamento di DSTYK mediato da CRISPR/Cas9 ha aumentato significativamente l'apoptosi delle cellule tumorali resistenti ai farmaci in vitro (cellule SUM102PT e cellule MDA-MB-468) e in un modello di TNBC in vivo (Ogbu et al., 2021).
Sebbene il TNBC presenti un'attivazione anomala della via MAPK, l'effetto clinico delle terapie mirate a MEK è scarso. Uno screening di librerie genomiche CRISPR/Cas9 ha rivelato che l'inibizione di PSMG2 (chaperone 2 per l'assemblaggio del proteasoma) sensibilizza le cellule TNBC BT549 e MB468 all'inibitore di MEK AZD6244. Il silenziamento di PSMG2 tramite CRISPR/Cas9 ha alterato la normale funzione del proteasoma, portando alla disassemblaggio di PDPK1 mediato dall'autofagia, migliorando ulteriormente le cellule tumorali nei modelli murini di TNBC indotti da AZD6244 (inibitore di MEK) e MG132 (inibitore del proteasoma). Pertanto, gli inibitori del proteasoma e della MAP chinasi (MEK) possono essere somministrati sinergicamente per ridurre la proliferazione delle cellule tumorali (Wang X. et al., 2022).
Il sistema CRISPR/Cas9 è stato utilizzato anche per individuare la perdita di funzione genica che porta alla resistenza del TNBC (Shu et al., 2020). Ge et al. hanno spiegato il meccanismo di resistenza ai farmaci delle cellule tumorali trattate con JQ1, un inibitore del bromodominio BET (BBDI), nel TNBC. Utilizzando CRISPR/Cas9, hanno scoperto che l'eliminazione del gene rb1 causava la resistenza del TNBC al farmaco antitumorale JQ1. Pertanto, la funzione di rb1 è importante nella risposta ai farmaci JQ1 nel TNBC. Hanno anche riportato che il paclitaxel è un inibitore della chinasi CDK4/6/microtubuli e che la sua combinazione con BBDI come JQ1 potrebbe fornire risposte terapeutiche promettenti al TNBC resistente ai farmaci (Ge et al., 2020).
È stato riportato che il panorama trascrizionale dell'RNA non codificante lungo (lncRNA) è responsabile della resistenza alla terapia neoadiuvante nel TNBC. Questo studio mostra che cinque diversi trascritti di lncRNA MALAT1 sono altamente espressi nel TNBC. Inoltre, la delezione di MALAT1 mediata da CRISPR/Cas9 ha aumentato la sensibilità delle cellule TNBC BT-549 al paclitaxel e alla doxorubicina, suggerendo un potenziale ruolo della resistenza MALAT1 nel TNBC (Shaath et al., 2021).
Le mutazioni del gene BRCA1 (BRCA1m) sono eterogenee e quindi difficili da rilevare. Il targeting di PARP1 (poli(ADP-ribosio) polimerasi), il partner letale sintetico di BRCA1, potrebbe aumentare la chemiosensibilità ai farmaci nel carcinoma mammario triplo negativo (TNBC). Utilizzando CRISPR/Cas9, la delezione di PARP1 ha aumentato la sensibilità ai farmaci antitumorali come doxorubicina, gemcitabina e docetaxel nelle cellule TNBC con mutazione mBRCA1, suggerendo che PARP1 sia coinvolto anche nella resistenza ai farmaci nel TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). È noto che le mutazioni nei geni oncosoppressori BRCA1 o BRCA2 aumentano la probabilità di sviluppare il cancro al seno. Il trattamento di queste pazienti richiede l'uso di inibitori di PARP. Inoltre, è stato dimostrato che l'eliminazione del fattore di recupero nucleotidico DNPH1 mediante CRISPR/Cas9 può rimuovere il nucleotide tossico 5-idrossimetildeossiuridina (hmdU) monofosfato, migliorando così la risposta delle cellule con deficit di BRCA alla sensibilità agli inibitori di PARP (Fugger et al., 2021). Pertanto, CRISPR/Cas9 e gli inibitori di PARP1 potrebbero diventare un'importante strategia di trattamento per il TNBC.
Il gene della glicoproteina penetrante (P-gp) è un gene di resistenza multifarmacologica che è generalmente sovraregolato in circa il 41% di tutti i tumori al seno triplo negativi (TNBC) (Sun et al., 2020). L'efflusso di farmaci indotto dalla P-gp è stato identificato come un regolatore chiave della resistenza ai farmaci nel tumore al seno. Gli inibitori della P-gp hanno dimostrato una maggiore sensibilità ai farmaci antitumorali nel tumore al seno (Famta et al., 2021). Pertanto, l'ablazione o la soppressione della P-gp mediata da CRISPR/Cas9 e gli inibitori della P-gp potrebbero essere metodi molto importanti per superare la resistenza ai farmaci nei TNBC.
È noto che il trasportatore a cassetta legante ATP G2 (ABCG2) causa resistenza ai farmaci nel TNBC (Palasuberniam et al., 2015), sebbene attualmente non vi siano studi sulla relazione tra CRISPR/Cas9 e silenziamento di ABCG2 e inattivazione del gene oncosoppressore. PTEN potrebbe potenziare l'attivazione di ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Pertanto, l'utilizzo di CRISPR/Cas9 per rimuovere ABCG2 e la sua combinazione con un inibitore di ABCG2 potrebbero rappresentare un trattamento adeguato per superare la resistenza ai farmaci nel TNBC. La Tabella 2 menziona il targeting di tutti i geni di resistenza tramite CRISPR/Cas9.
Tabella 2. CRISPR/Cas9 prende di mira diversi geni di resistenza al TNBC per sensibilizzare le cellule ai farmaci antitumorali.
Le librerie CRISPR/Cas9 sono strumenti potenziali per lo screening delle mutazioni geniche associate alla patogenesi del cancro (Chan et al., 2022). Questo metodo di screening prevede quattro fasi: (a) costruzione della libreria, (b) trasduzione lentivirale, (c) screening fenotipico e (d) analisi del gene bersaglio. Sebbene il TNBC presenti un'attivazione anomala della via MAPK, la prognosi clinica della terapia mirata a MEK per i pazienti affetti da TNBC portatori di mutazioni in geni oncosoppressori come PTEN, RB1 e TP53 è molto sfavorevole.
Inoltre, uno screening di knockout genico mediante CRISPR/Cas9 ha testato la molecola più potente e selettiva, il deidrocatrolo, abbondante negli estratti di fiori e foglie guatemaltechi, per comprendere l'effetto del deidrocatrolo sulle cellule MDA-MB-231. Meccanismi di citotossicità cellulare selettiva. Caratteristiche di staminalità mesenchimale dei sottotipi di TNBC. Questo screening basato su CRISPR/Cas9 ha anche rivelato che HSD17B11, un gene che codifica per la 17β-idrossisteroide deidrogenasi di tipo 11, è altamente espresso nelle cellule MDA-MB-231 e determina la produzione di deidrofalcarinolo specifico per le cellule MDA-MB-231 (Grant et al., 2020). Pertanto, ciò suggerisce che lo screening genomico CRISPR/Cas9 ha un grande potenziale nell'identificazione dei meccanismi alla base delle proprietà antitumorali di potenziali composti naturali.
Inoltre, la vulnerabilità del TNBC al cancro è stata studiata utilizzando uno screening CRISPR/Cas9 in vivo a livello genomico non mirato, che ha mostrato un collegamento tra le vie oncogeniche e quelle di soppressione tumorale. È stato riportato che i componenti chiave delle vie mTOR e Hippo svolgono un ruolo importante nella regolazione tumorale nel TNBC. Inoltre, studi hanno dimostrato che l'inibizione farmacologica di mTORC1/2 e dell'oncoproteina YAP inibisce efficacemente la patogenicità del TNBC utilizzando un modello di sinergia farmaco-matrice in vitro e xenotrapianti derivati da pazienti in vivo. Inoltre, l'inibizione di mTORC1/2 mediata da Torin-1 aumenta la macropinocitosi, mentre l'inibizione di YAP indotta da verteporfina porta alla morte delle cellule TNBC. Nel complesso, questi risultati evidenziano la potenza e la robustezza dello screening CRISPR in vivo a livello genomico per identificare trattamenti nuovi ed efficaci per il TNBC (Dai et al., 2021).
La disregolazione del sistema immunitario è un fattore importante nella tumorigenesi. Le cellule tumorali eludono l'eliminazione da parte del sistema immunitario aggirando i meccanismi di difesa, tra cui l'interferenza con l'attività delle cellule immunitarie nel microambiente tumorale e la compromissione del sistema immunitario stesso. Pertanto, lo sviluppo di un sistema immunitario più efficiente potrebbe rappresentare un approccio chiave per combattere i tumori. L'utilizzo della modificazione genetica basata su CRISPR/Cas9 affronta diverse problematiche legate alla disfunzione immunitaria da prospettive differenti. CRISPR/Cas9 è stato utilizzato per migliorare l'immunità antitumorale contro il cancro al seno attraverso le seguenti vie (Figura 3).
Figura 3. L'immunoterapia CRISPR/Cas9 è mirata alle cellule TNBC. La perdita di CDK5 e la riduzione dell'espressione di PDL1 e CD155 potenziano il sistema immunitario. Allo stesso modo, la perdita di A2AR e la riduzione dell'espressione di TAA come HER2, mucina 1 e TEM8 hanno aumentato l'efficacia delle cellule CAR-T nell'uccidere le cellule tumorali. Lo screening delle cellule T guidato da CRISPR/Cas9 ha dimostrato che l'interruzione della chinasi p38 potenzia l'attività antitumorale delle cellule T. Le cellule T modificate da CRISPR/Cas9 aumentano l'espressione del TCR (recettore delle cellule T), conferendo alle cellule T attività antitumorale.
L'obiettivo dell'immunoterapia è stimolare il sistema immunitario ad attaccare le cellule tumorali. La sovraespressione delle proteine checkpoint immunitarie di solito previene le reazioni autoimmuni, ma può aiutare i tumori a evitarle (Topalian et al., 2015). Queste proteine prevengono le reazioni immunitarie legandosi ai recettori presenti sulla superficie delle cellule immunitarie. Diverse proteine checkpoint (come CD155 e PD-L1) prendono di mira il recettore PD-1 sulle cellule immunitarie e sono espresse nel carcinoma mammario, in particolare nel TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). La riduzione dell'espressione di PD-L1 o del suo recettore mediante CRISPR/Cas9 può stimolare il sistema immunitario ad attaccare i tumori TNBC (Yahata et al., 2019). Inoltre, è stato dimostrato che la riduzione dell'espressione di PD-L1 tramite la delezione di CDK5 mediata da CRISPR/Cas9 inibisce la crescita tumorale in vitro e in vivo (Deng et al., 2020). L'inibizione della crescita in modelli in vitro e in vivo di cancro al seno suggerisce che la riduzione di CD155 mediata da shRNA potrebbe avere un effetto terapeutico sul cancro al seno (Gao et al., 2018).
Le cellule CAR T esprimono CAR che riconoscono gli antigeni associati al tumore (TAA) e possono utilizzare la soppressione delle proteine checkpoint per potenziarne l'attività (Li C. et al., 2020). Esistono diversi potenziali bersagli per la terapia con cellule CAR T nel carcinoma mammario, tra cui diversi TAA come HER2, mucina1 e TEM8 (Bajgain et al., 2018). Vi sono prove che le cellule CAR T che prendono di mira la mesotelina (sovraespressa nelle cellule TNBC BT-459) siano più efficaci contro il cancro quando PD-1 viene inattivato utilizzando CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Tuttavia, isolare le cellule T dai pazienti e modificarle ex vivo è un processo laborioso e che richiede molto tempo. Sebbene le cellule T universali possano ridurre i requisiti di isolamento, le cellule T del donatore che esprimono l'antigene leucocitario umano (HLA) di classe I e il recettore delle cellule T (TCR) dovrebbero essere rimosse per prevenire anomalie del trapianto contro l'ospite (Ren et al., 2017, 2017a). Utilizzando CRISPR/Cas9, l'HDR può eliminare simultaneamente TCR e HLA e silenziare il gene che codifica per il CAR. Studi hanno dimostrato che CRISPR/Cas9 può essere utilizzato per introdurre CAR anti-CD19 nel locus TCR, producendo così CAR in modo efficiente senza deplezione delle cellule T (Dimitri et al., 2022). Sono state sviluppate tecnologie multiplex per generare cellule T CAR allogeniche eliminando simultaneamente TCR, beta-2-microglobulina (B2M), subunità HLA-I e altre proteine come PD-1 e CTLA-4, che potrebbero avere maggiori proprietà antitumorali. contro TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
L'utilizzo di CRISPR/Cas9 potrebbe migliorare l'efficacia delle cellule CAR-T. L'adenosina è nota per le sue proprietà immunosoppressive e può ridurre l'immunità antitumorale bloccando la funzione delle cellule T e attivando i recettori dell'adenosina A2A (A2AR) (Vigano et al., 2019). Il silenziamento di A2AR tramite CRISPR/Cas9 ha migliorato significativamente l'efficacia delle cellule CAR-T in vivo (Giuffrida et al., 2021). È noto che le cellule T presentano diverse caratteristiche fenotipiche, come l'espansione cellulare, la differenziazione, lo stress ossidativo e lo stress genomico. Lo screening delle cellule T basato su CRISPR/Cas9 ha rivelato l'interruzione di 25 diverse chinasi del recettore delle cellule T. Tra queste, la delezione della chinasi p38 ha dimostrato di potenziare l'attività antitumorale delle cellule T, indicando che la chinasi p38 è un regolatore chiave della regolazione delle cellule CAR-T (Gurusamy et al., 2020).
Le cellule T possono essere modificate geneticamente utilizzando CRISPR/Cas9 per produrre TCR altamente espressi. Il trasferimento di cellule T geneticamente modificate ai pazienti ha dimostrato un'attività antitumorale più forte rispetto alle cellule T endogene. Pertanto, i TCR endogeni possono competere con i TCR geneticamente modificati nei pazienti, il che potrebbe influenzare il potenziale dell'immunoterapia contro il cancro. Per superare questo problema, l'utilizzo di CRISPR/Cas9 per rimuovere il TCR-β endogeno nelle cellule riceventi e successivamente trasferire cellule T TCR-β ai pazienti oncologici potrebbe mostrare migliori risposte immunitarie antitumorali senza la necessità di competizione sessuale del TCR endogeno (Fan et al. 2018). Pertanto, ad eccezione delle cellule T modificate con CRISPR, i TCR sono mille volte più sensibili agli antigeni tumorali rispetto alle cellule T trasdotte con TCR normale. Inoltre, in diverse leucemie, le cellule T modificate generate da γδ TCR+ CRISPR mostrano una maggiore espressione di cellule T CD4+ e CD8+ rispetto al trasferimento TCR standard (Legut et al., 2018). Pertanto, le cellule T modificate generate da CRISPR/Cas9 potrebbero rappresentare un metodo di immunoterapia efficace per contrastare il TNBC.
Le integrine sono molecole di adesione cellulare presenti nelle membrane transmembrana delle cellule e promuovono il legame delle cellule alla matrice extracellulare (ECM) (Hamidi e Ivaska, 2018). La disregolazione delle integrine è associata allo sviluppo e alla migrazione del cancro, alterando la matrice extracellulare e favorendo la sopravvivenza delle cellule tumorali in circolo (Hamidi e Ivaska, 2018). La riduzione dell'espressione delle integrine mediata da CRISPR/Cas9 rallenta la progressione tumorale, le metastasi e la colonizzazione nel TNBC. È stato riportato che la riduzione dell'espressione dell'integrina α5 (ITGA5) diminuisce la migrazione e la progressione cellulare in altri tumori, come il carcinoma polmonare (Ju et al., 2017), suggerendo che l'integrina α5 possa essere un fattore chiave anche nella patogenesi del TNBC.
La generazione di topi knockout utilizzando i metodi tradizionali basati su cellule staminali embrionali (ES) è un processo laborioso, lungo e inefficiente. Sono necessari mesi o anni per selezionare le cellule ES tramite ricombinazione omologa, allevare topi chimerici e poi incrociarli con topi eterozigoti per produrre prole omozigote. È necessario un complesso processo di incrocio per creare topi con mutazioni genetiche multiple. Tuttavia, sono emersi molti problemi nell'utilizzo di topi generati mediante ablazione di cellule ES con CRISPR/Cas9 o mediante microiniezione di componenti CRISPR/Cas9 in ovociti fecondati a singola cellula. Ad esempio, l'introduzione di modifiche si verifica spesso in loci biallelici e non è specifica per un singolo gene. È stato recentemente dimostrato che le cellule ES, utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9, possono inserire simultaneamente mutazioni bialleliche in un massimo di 5 geni (Nishizono et al., 2021). A tale scopo, l'mRNA di Cas9 e cinque gRNA specifici per ciascun gene sono stati trasfettati simultaneamente nelle cellule ES. Ciò evidenzia le potenzialità e l'efficacia di questa procedura, sebbene queste mutazioni possano essere state trasmesse quando le linee fondatrici sono state allevate per produrre topi knockout quintupli. Lo studio riporta anche una scoperta sorprendente: le cellule ES non sono più necessarie per creare topi geneticamente modificati. Invece, per rimuovere specifici prodotti genici, l'mRNA di Cas9 e l'gRNA sono stati iniettati in embrioni allo stadio di singola cellula. Di conseguenza, sono state create linee fondatrici knockout che possono essere teoricamente utilizzate per studiare le conseguenze della delezione genica nei topi (Qin et al., 2016). Pertanto, CRISPR/Cas9 consente la creazione di topi transgenici per il trattamento del TNBC a un costo inferiore rispetto all'ingegneria genetica tradizionale. Utilizzando il sistema CRISPR/Cas, è stato sviluppato un nuovo modello di topo knockout in grado di introdurre con successo mutazioni puntiformi in uno o più geni endogeni nel TNBC. Sulla base di questo concetto, è possibile sviluppare modelli animali di TNBC utilizzando la delezione mediata da CRISPR/Cas9 di BRCA1 e p53, con conseguente perdita della riparazione HR, instabilità genomica e fenotipi mutanti (Annunziato et al., 2020).
Attualmente, per la diagnosi del tumore al seno triplo negativo (TNBC) si utilizzano diversi metodi, come la mammografia, la risonanza magnetica (RM) e l'ecografia. Tuttavia, questi metodi presentano alcune limitazioni. La mammografia viene utilizzata per diagnosticare il tessuto mammario locale, non le metastasi, ovvero le aree in cui le cellule tumorali si sono diffuse ad altri organi. L'ecografia non è un metodo affidabile per la diagnosi di TNBC (Chen e Lee-Felker, 2023). La risonanza magnetica ha una sensibilità maggiore rispetto all'ecografia e alla mammografia, ma la sua accuratezza diagnostica è limitata (Sha e Chen, 2022). La biopsia tissutale è una procedura invasiva per identificare le cellule tumorali. Tuttavia, in alcuni casi, la biopsia potrebbe non rilevare il tessuto canceroso se l'ago si sposta dall'area di interesse. Inoltre, è molto costosa e può essere traumatica per la paziente. Il TNBC è un tipo di tumore eterogeneo, pertanto una biopsia potrebbe non fornire informazioni sufficienti sulla sua tipologia. Di conseguenza, è urgentemente necessario un nuovo metodo diagnostico affidabile per la rilevazione del TNBC. Il sistema CRISPR/Cas9 potrebbe rappresentare un'alternativa altamente sensibile e minimamente invasiva per la diagnosi del tumore al seno. A tal fine, le strategie basate su CRISPR/Cas9 possono essere utilizzate per migliorare i metodi PCR per la diagnosi del tumore al seno triplo negativo (TNBC). In primo luogo, le proteine Cas9 e cpf1 del sistema CRISPR vengono utilizzate per rimuovere il DNA non specifico, e successivamente queste due proteine (Cas9 e cpf1) possono riconoscere la sequenza PAM prima di legarsi al DNA bersaglio (Deepak Singh et al., 2021). In questo modo, la PCR può identificare le mutazioni associate allo sviluppo del cancro. Diversi studi hanno adottato questa strategia basata su CRISPR per rilevare diverse mutazioni in diversi tipi di cancro (Safari et al., 2019). Pertanto, i metodi PCR basati su CRISPR potrebbero ridurre la dipendenza della diagnosi di TNBC da metodi invasivi come l'immunoistochimica basata su biopsia.
Sono state inoltre dimostrate alterazioni genotipiche nella regolazione dei recettori ormonali nel TNBC (Chen e Russo, 2009). Le strategie PCR basate su CRISPR/Cas9 che utilizzano microarray per la diagnostica point-of-care possono monitorare efficacemente queste mutazioni (Hajian et al., 2019). Potrebbero inoltre fornire agli operatori sanitari informazioni rilevanti su mutazioni specifiche nei pazienti affetti da TNBC, contribuendo a migliorare il loro percorso terapeutico. Tuttavia, questa tecnica combinata presenta delle limitazioni. Pertanto, sono necessari ulteriori studi prima che il metodo CRISPR/Cas-PCR possa essere utilizzato in ambito sanitario per la diagnosi del TNBC (Yang et al., 2019).
Data di pubblicazione: 14 ottobre 2024